Accurate quantification of Illumina® NGS libraries using Clarity digital PCR system
I. Overview
차세대 시퀀싱(NGS)은 높은 해상도와 정확성으로 게놈 데이터를 신속하게 얻게 해줍니다. 특히 Illumina® 시퀀싱에서는 Flow Cell에 로드하는 DNA 라이브러리의 양이 데이터 품질을 결정하는 핵심입니다.
라이브러리 양이 너무 적거나 많으면 시퀀싱 수율 감소 및 데이터 품질 저하를 초래하므로, Flow Cell 로드 전 정확한 라이브러리 정량이 필수적입니다.
기존의 정량법(분광 광도, 형광 분석)은 전체 DNA 양만 측정하여 정확도가 낮고, qPCR은 정확하지만 표준 곡선 생성에 시간과 비용이 많이 듭니다.
이러한 한계를 극복하는 것이 바로 디지털 PCR(dPCR) 이며, 다음과 같은 장점을 가지고 있습니다.
>표준 곡선 불필요: 복잡한 과정 없이 바로 정량합니다.
>빠르고 정확: NGS 라이브러리를 신속하고 정밀하게 정량할 수 있습니다.
본 내용은 Clarity digital PCR system을 사용하여 NGS 시퀀싱 라이브러리를 정확하게 정량할 수 있음을 보여주어, 여러분의 NGS 실험 성공률을 높이는 방법을 제시합니다.
Figure 1. Illumina® NGS library quantification workflow using Clarity digital PCR system.
II. Clarity plus PCR system accurately quantifies DNA fragments flanked by the Illumina® P5 and P7 sequences
Clarity digital PCR (dPCR) 시스템의 Illumina® NGS 라이브러리 정량에 대한 정확성 및 정밀도는 P5 및 P7 flow cell 옆에 있는 DNA 표준 물질(standards)을 사용하여 성공적으로 검증되었습니다.
>검증 수단: P5 및 P7 flow cell 옆에 위치한 DNA 표준 물질.
>서열 정보: 이 검증에 사용된 서열 정보는 Table 1과 Figure 2에 제시되어 있습니다.
| DNA Standard | Expected concentration (copies/µL) |
Measured Concentration (copies /µL) |
Relative Uncertainty (%) |
| 4 | 1205 | 1547 | 2.80 |
| 4/2* | 603 | 790 | 1.39 |
| 5 | 121 | 148 | 2.37 |
| 5/2* | 60 | 74 | 3.99 |
| 6 | 12 | 15 | 2.38 |
| 6/2* | 6 | 8 | 4.94 |
| Table 1. Quantification of the Illumina® NGS standards using Clarity digital PCR system. The EvaGreen® dye-based digital PCR assay was designed to amplify the 452bp library fragment using primers that target the P5 (5’AATGATACGGCGACCACCGA-3’) and P7 (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’) sequences. Analyses were performed on Standards 4, 5, 6, and their respective two-fold dilutions (marked with an asterisk), whose expected copies per microliter of reaction fall within the dynamic range of the system. The results shown are representative of three independent experiments performed in triplicates. | |||
Figure 2. Graphical representation of the results obtained in Table 1. Error bars denote standard deviations of each set of triplicates
III. Conclusion
Clarity digital PCR (dPCR) 시스템을 사용하면 Illumina® NGS 라이브러리를 정확하게 정량할 수 있습니다.
이는 NGS 실험의 성공에 다음과 같은 핵심적인 이점을 제공합니다:
>최적의 클러스터 밀도 확보: 정확한 정량을 통해 Flow Cell에 로드할 라이브러리의 양을 정밀하게 조절할 수 있습니다.
이를 통해 시퀀싱에 이상적인 최적의 클러스터 밀도를 달성할 수 있습니다.
>고품질 시퀀싱 데이터 생성: 최적의 밀도는 클러스터 신호가 서로 겹치지 않고 명확하게 구분되는 것을 보장하여, 결국 오류가 적고 신뢰도 높은 고품질 시퀀싱 데이터를 생성할 수 있게 됩니다.
>수율 및 효율성 극대화: 라이브러리 정량이 부정확할 때 발생하는 재실험의 필요성을 줄여 시간과 비용을 절약하고, 시퀀싱 수율(Yield)을 극대화합니다.
IV.References
[1] Illumina (2015) An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology.
[2] Huggett JF, Cowen S and Foy CA. (2015) Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 61, 79-88.
[3] Baker M. (2012) Digital PCR hits its stride. Nature Methods 9, 541–544.
[4] KAPA Biosystems (2014) KAPA Library Quantification Technical Guide (KAPA Library Quantification Kits for Illumina® platforms)
Equipment
Clarity Plus Digital PCR system 상세보기
• 절대 정량
• 샘플 손실 최소화
• 정확성 향상
• 빠른 처리 시간
• 연구자만의 분석 방법 설계 가능
Applications
• Cell-free nucleic acid analysis
• Quantification of reference materials
• Copy number variant analysis
• Bacterial / Viral load quantification
• Next-generation sequencing (NGS) applications
• Minimum Sample Loss
• Fast Turnaround Time
• Ability to design your own assay
• SNP quantification
• Rare variant detections
• Genomic alterations
• Gene expression analysis
• Digital PCR assay customization
