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Multiplex 1-step RT-qPCR assay
qPCR assay
작성일
2021-06-18 18:14
Multiplex 1-step RT-qPCR assay for accurate and sensitive detection of SARS-CoV-2
by Andrea Corr, BSc and Matteo Beretta, PhD
Introduction
2019년 코로나 바이러스 질병 (COVID-19)의 출현과 급속한 확산으로 인해 전 세계 국가와 사람들이 심각한 위협을 받고 있습니다.
COVID-19의 원인은 박쥐에서 유래한 것으로 여겨지는 전염성 높은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)입니다.
바이러스는 주로 호흡기 비말과의 직접적인 접촉을 통해 인간 상호간에 전염됩니다.
코로나 바이러스의 구조는 다음과 같습니다.
Figure 1. Structure of SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 genome 은 아래 그림과 같이 구성되어 있습니다.
Figure 2. Organization of the SARS-CoV-2 genome
COVID-19와 같은 새로운 바이러스 질병의 출현은 대상 바이러스를 규모에 맞게 감지하고 식별하는 신속한 방법의 필요성을 제기합니다.
강력하고 효과적인 추적을 위한 반복되는 실험은 전염병을 통제하는 핵심이라고 할 수 있습니다.
테스트 측면에서, 환자의 비인두로부터 면봉을 사용하여 샘플을 채취 하고 격리 실험실에서 RT-qPCR 기반의 검출 과정을 실행하는 것이 표준 절차로 간주되고 있습니다.
Multiplex testing
SARS-CoV-2에 대한 RT-qPCR 기반 검출은 단일 well에서 단일 표적 시퀀스를 증폭하는 singleplex 또는 구별되는 형광을 붙인 프로브와 함께 여러 프라이머 쌍을 사용하여 동시에 증폭하는 multiplex로 수행할 수 있습니다.
추운 날엔 실시하는 SARS-CoV-2 검사는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 호흡기 세포 바이러스(RSV)와 같은 일반적인 계절 바이러스와 사스-CoV-2를 구별하기 위해 고안된 multiplexed respiratory panel test의 일부가 될 가능성이 높습니다.
Multiplex 검사는 상당한 시간, 노력이 들고, 반면 시약 사용을 절약할 수 있지만, 한 번의 RT-qPCR 반응에서 증가된 표적 수를 고려할 때 최적화하기는 훨씬 어렵습니다.
여기서는 SARS-CoV-2 검출을 위한 신속하고 민감한 Multiplex RT-qPCR 분석을 자세히 설명하도록하겠습니다.
Target sequences
아래와 같은 4 개의 표적 서열을 분석했습니다 (표 1).
Table 1. SARS-CoV-2 and human RNase P primer and probe sequences
RNA template
바이러스 게놈(ATCC) 희석 작업은 PCR grade dH20을 사용하여 수행되었습니다.
10배 희석 배율로 5개의 연속적인 dilutions을 만들었습니다.
5μL의 40,000개 copy로 시작하였고 template control (NTC)은 포함하지 않았습니다.
Reaction setup
The PCR master mix 는 최종 20μL로 아래 표2 와 같이 준비 하였습니다.
Table 2. Reaction setup
4 세트의 프라이머 쌍 (F+R)을 혼합하여 각 올리고 뉴클레오티드에 대해 10μM의 최종 농도를 얻었습니다.
(예 : 100μM + 20μL PCR 등급 dH2O에서 프라이머의 8 개 스톡 각각에 대해 10μL).
유사하게 4 개의 프로브를 혼합하여 각각 10μM의 최종 농도를 얻었습니다
(예 : 100μM + 60μL PCR 등급 dH2O에서 4 개의 프로브 스톡 각각에 대해 10μL).
Cycling conditions
최적의 RT-qPCR 프로그램은 표3와 같습니다.
Table 3. Cycling conditions
Results
SARS-CoV-2 바이러스 표적의 모든 희석된 샘플은 고효율 값을 갖는 이 fourplex RT-qPCR 프로그램에서 검출되었습니다 (그림 3 및 표 4 참조).
평균 첫 번째 Ct는 40,000 copy에 대해 24.74 였고 4개의 바이러스 copy에 대해 평균 최종 Ct는 39.16이었습니다.
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect는 multiflex에서 SARS-CoV-2 표적을 감지하는 데 효율적으로 사용할 수 있으며, 높은 특이 도와 감도로 20μL 반응 당 4개 copy (μL 당 0.8 copy)까지 테스트 되었습니다.
Figure 3. Multiplex detection of SARS-CoV-2 nucleic acid using qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect
Table 4. Mean Ct and standard deviation values
Discussion
올바르게 수행되면 RT-qPCR 테스트는 매우 민감하고 구체적이며 SARS-Cov-2 genomic material의 검출에 의한 COVID-19 진단을 위한 표준 진단법을 제공합니다.
그러나 "positive" PCR 결과는 바이러스 RNA의 검출 만을 반영하고 바이러스의 존재를 반드시 나타내지는 않는다는 점에 유의해야 합니다.
이 검사의 목표는 매우 낮은 양의 바이러스 RNA가 환자로부터 검출될 수 있도록 하는 것입니다.
바이러스의 확산을 줄이기 위해서는 가능한 한 일찍 이러한 ‘low-positive’ 환자를 탐지하는 것이 중요합니다.
멀티플렉스 테스트는 하나의 qPCR 반응으로 여러 호흡기 바이러스 대상을 테스트할 수 있기 때문에 샘플 처리와 관련하여 귀중한 시간을 절약할 수 있습니다.
멀티플렉스 RT-qPCR 반응을 최적화하는 것은 어렵고 비용이 많이들 수 있으므로, 이 애플리케이션 노트에서 최적의 결과를 위한 RT-qPCR 매개 변수와 master mix를 만들기 위한 제안을 자세히 설명합니다.
FDA가 2020년 6월에 내놓은 아이디어인 환자 샘플을 풀링하는 것은 무증상 환자를 선별하는 데 유용하며 다수의 음성 환자 샘플을 빠르게 무시할 수 있기 때문에 가치가 있습니다.
그런 다음 양성 반응이 나온 pooled samples에만 추가 테스트와 조사를 집중할 수 있습니다.
이 글을 쓰는 시점에서 R값은 다시 한 번 상승하고 있습니다.
이 바이러스가 인구에서 영원히 지속될 것인지 또는 계절성 독감의 경우처럼 사람들이 반복적 인 예방접종을 받을 것인지는 알려져 있지 않습니다.
그러나 예방 접종이 없는 상황에서 빠르고 효율적인 진단은 이 바이러스의 확산을 제어하고 향후 수개월 및 수년 동안 전 세계적으로 사회적, 경제적 영향을 줄이는 핵심입니다.
Product use
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect 만으로는 진단 결과를 제공하지 않으며 연구용으로만 제공됩 니다.
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect > 제품 정보 자세히 보기
References
• COVID-19 Dashboard by the Centre for Systems Science and Engineering at Johns Hopkins University accessed 11th November 2020 (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)
• Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate WuhanHu-1, complete genome (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ MN908947)
• Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR (https:// www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf)
• Research Use Only 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time RT-PCR Primers and Probes (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html)
• Coronavirus (COVID-19) Update: Facilitating Diagnostic Test Availability for Asymptomatic Testing and Sample Pooling, (https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/ coronavirus-covid-19-update-facilitating-diagnostic-test-availabilityasymptomatic-testing-and)
by Andrea Corr, BSc and Matteo Beretta, PhD
Introduction
2019년 코로나 바이러스 질병 (COVID-19)의 출현과 급속한 확산으로 인해 전 세계 국가와 사람들이 심각한 위협을 받고 있습니다.
COVID-19의 원인은 박쥐에서 유래한 것으로 여겨지는 전염성 높은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)입니다.
바이러스는 주로 호흡기 비말과의 직접적인 접촉을 통해 인간 상호간에 전염됩니다.
코로나 바이러스의 구조는 다음과 같습니다.
Figure 1. Structure of SARS-CoV-2
SARS-CoV-2 genome 은 아래 그림과 같이 구성되어 있습니다.
Figure 2. Organization of the SARS-CoV-2 genome
COVID-19와 같은 새로운 바이러스 질병의 출현은 대상 바이러스를 규모에 맞게 감지하고 식별하는 신속한 방법의 필요성을 제기합니다.
강력하고 효과적인 추적을 위한 반복되는 실험은 전염병을 통제하는 핵심이라고 할 수 있습니다.
테스트 측면에서, 환자의 비인두로부터 면봉을 사용하여 샘플을 채취 하고 격리 실험실에서 RT-qPCR 기반의 검출 과정을 실행하는 것이 표준 절차로 간주되고 있습니다.
Multiplex testing
SARS-CoV-2에 대한 RT-qPCR 기반 검출은 단일 well에서 단일 표적 시퀀스를 증폭하는 singleplex 또는 구별되는 형광을 붙인 프로브와 함께 여러 프라이머 쌍을 사용하여 동시에 증폭하는 multiplex로 수행할 수 있습니다.
추운 날엔 실시하는 SARS-CoV-2 검사는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 호흡기 세포 바이러스(RSV)와 같은 일반적인 계절 바이러스와 사스-CoV-2를 구별하기 위해 고안된 multiplexed respiratory panel test의 일부가 될 가능성이 높습니다.
Multiplex 검사는 상당한 시간, 노력이 들고, 반면 시약 사용을 절약할 수 있지만, 한 번의 RT-qPCR 반응에서 증가된 표적 수를 고려할 때 최적화하기는 훨씬 어렵습니다.
여기서는 SARS-CoV-2 검출을 위한 신속하고 민감한 Multiplex RT-qPCR 분석을 자세히 설명하도록하겠습니다.
Target sequences
아래와 같은 4 개의 표적 서열을 분석했습니다 (표 1).
| Target gene | Description | Assay | Sequence (5’-3’) | Concentration (nM) |
| RdRp | RdRP_SARSr-F2 | WHO/Charité | GTGARATGGTCATGTGTGGCGG | 400 |
| RdRP_SARSr-R1 | CARATGTTAAASACACTATTAGCATA | 400 | ||
| RdRP_SARSr-P2 | TexasRed-CAGGTGGAACCTCATCAGGAGATGC-BHQ2 | 160 | ||
| E | E_Sarbeco_F1 | WHO/Charité | ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT | 400 |
| E_Sarbeco_R1 | ATATTGCAGCAGTACGCACACA | 400 | ||
| E_Sarbeco_P2 | FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1 | 160 | ||
| N (sequence 2) | 2019-nCoV_N2-F | CDC | TTACAAACATTGGCCGCAAA | 400 |
| 2019-nCoV_N2-R | GCGCGACATTCCGAAGAA | 400 | ||
| 2019-nCoV_N2-P | Cy5-ACAATTTGCCCCCAGCGCTTCAG-BHQ2 | 160 | ||
| RNase P | RPP30 F | Extraction Control | AGATTTGGACCTGCGAGCG | 400 |
| RPP30 R | GAGCGGCTGTCTCCACAAGT | 400 | ||
| RPP30 P | HEX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ1 | 160 |
Table 1. SARS-CoV-2 and human RNase P primer and probe sequences
RNA template
바이러스 게놈(ATCC) 희석 작업은 PCR grade dH20을 사용하여 수행되었습니다.
10배 희석 배율로 5개의 연속적인 dilutions을 만들었습니다.
5μL의 40,000개 copy로 시작하였고 template control (NTC)은 포함하지 않았습니다.
Reaction setup
The PCR master mix 는 최종 20μL로 아래 표2 와 같이 준비 하였습니다.
| Reagent | Volume | Final conc. |
| 20x UltraScript RTase | 1μL | 1x |
| 4x PCRBIO Probe 1-Step Virus Detect | 5μL | 1x |
| Primer mix (10µM) | 0.8μL | 400nM |
| Probe (10µM) | 0.32μL | 160nM |
| RNA template | 5µL | Variable |
| PCR grade dH2O | 4.52µL | – |
Table 2. Reaction setup
4 세트의 프라이머 쌍 (F+R)을 혼합하여 각 올리고 뉴클레오티드에 대해 10μM의 최종 농도를 얻었습니다.
(예 : 100μM + 20μL PCR 등급 dH2O에서 프라이머의 8 개 스톡 각각에 대해 10μL).
유사하게 4 개의 프로브를 혼합하여 각각 10μM의 최종 농도를 얻었습니다
(예 : 100μM + 60μL PCR 등급 dH2O에서 4 개의 프로브 스톡 각각에 대해 10μL).
Cycling conditions
최적의 RT-qPCR 프로그램은 표3와 같습니다.
| Cycles | Temperature | Time | Notes |
| 1 | 55°C | 10 minutes | Reverse transcription |
| 1 | 95°C | 3 minutes | Polymerase activation and RTase inactivation |
| 50 | 95°C 58°C |
15 seconds 30 seconds |
Denaturation Anneal/extension |
Table 3. Cycling conditions
Results
SARS-CoV-2 바이러스 표적의 모든 희석된 샘플은 고효율 값을 갖는 이 fourplex RT-qPCR 프로그램에서 검출되었습니다 (그림 3 및 표 4 참조).
평균 첫 번째 Ct는 40,000 copy에 대해 24.74 였고 4개의 바이러스 copy에 대해 평균 최종 Ct는 39.16이었습니다.
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect는 multiflex에서 SARS-CoV-2 표적을 감지하는 데 효율적으로 사용할 수 있으며, 높은 특이 도와 감도로 20μL 반응 당 4개 copy (μL 당 0.8 copy)까지 테스트 되었습니다.
Figure 3. Multiplex detection of SARS-CoV-2 nucleic acid using qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect
| RdRp gene (Texas Red) | E gene (FAM) | N2 (Cy5) | RNase P (HEX) | |||||||||
| RNA copies | Mean Ct | SD Ct | n | Mean Ct | SD Ct | n | Mean Ct | SD Ct | n | Mean Ct | SD Ct | n |
| 40,000 | 24.25 | 0.05 | 4 | 25.43 | 0.04 | 4 | 24.65 | 0.08 | 4 | 24.63 | 0.07 | 4 |
| 4,000 | 27.36 | 0.04 | 4 | 28.07 | 0.04 | 4 | 27.78 | 0.02 | 4 | 27.72 | 0.07 | 4 |
| 400 | 30.78 | 0.14 | 4 | 31.44 | 0.09 | 4 | 31.22 | 0.12 | 4 | 30.89 | 0.17 | 4 |
| 40 | 33.87 | 0.62 | 4 | 34.99 | 0.17 | 4 | 34.84 | 1.10 | 4 | 33.68 | 0.76 | 4 |
| 4 | 37.87 | 1.27 | 4 | 38.99 | 1.65 | 2 | 39.10 | 0.72 | 2 | 40.67 | 1.37 | 3 |
| NTC | 37.96 | 0.62 | 4 | N/A | 0.00 | 0 | N/A | 0.00 | 0 | N/A | 0.00 | 0 |
Table 4. Mean Ct and standard deviation values
Discussion
올바르게 수행되면 RT-qPCR 테스트는 매우 민감하고 구체적이며 SARS-Cov-2 genomic material의 검출에 의한 COVID-19 진단을 위한 표준 진단법을 제공합니다.
그러나 "positive" PCR 결과는 바이러스 RNA의 검출 만을 반영하고 바이러스의 존재를 반드시 나타내지는 않는다는 점에 유의해야 합니다.
이 검사의 목표는 매우 낮은 양의 바이러스 RNA가 환자로부터 검출될 수 있도록 하는 것입니다.
바이러스의 확산을 줄이기 위해서는 가능한 한 일찍 이러한 ‘low-positive’ 환자를 탐지하는 것이 중요합니다.
멀티플렉스 테스트는 하나의 qPCR 반응으로 여러 호흡기 바이러스 대상을 테스트할 수 있기 때문에 샘플 처리와 관련하여 귀중한 시간을 절약할 수 있습니다.
멀티플렉스 RT-qPCR 반응을 최적화하는 것은 어렵고 비용이 많이들 수 있으므로, 이 애플리케이션 노트에서 최적의 결과를 위한 RT-qPCR 매개 변수와 master mix를 만들기 위한 제안을 자세히 설명합니다.
FDA가 2020년 6월에 내놓은 아이디어인 환자 샘플을 풀링하는 것은 무증상 환자를 선별하는 데 유용하며 다수의 음성 환자 샘플을 빠르게 무시할 수 있기 때문에 가치가 있습니다.
그런 다음 양성 반응이 나온 pooled samples에만 추가 테스트와 조사를 집중할 수 있습니다.
이 글을 쓰는 시점에서 R값은 다시 한 번 상승하고 있습니다.
이 바이러스가 인구에서 영원히 지속될 것인지 또는 계절성 독감의 경우처럼 사람들이 반복적 인 예방접종을 받을 것인지는 알려져 있지 않습니다.
그러나 예방 접종이 없는 상황에서 빠르고 효율적인 진단은 이 바이러스의 확산을 제어하고 향후 수개월 및 수년 동안 전 세계적으로 사회적, 경제적 영향을 줄이는 핵심입니다.
Product use
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect 만으로는 진단 결과를 제공하지 않으며 연구용으로만 제공됩 니다.
qPCRBIO Probe 1-Step Virus Detect > 제품 정보 자세히 보기
References
• COVID-19 Dashboard by the Centre for Systems Science and Engineering at Johns Hopkins University accessed 11th November 2020 (https://coronavirus.jhu.edu/map.html)
• Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate WuhanHu-1, complete genome (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ MN908947)
• Diagnostic detection of 2019-nCoV by real-time RT-PCR (https:// www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/protocol-v2-1.pdf)
• Research Use Only 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-time RT-PCR Primers and Probes (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019ncov/lab/rt-pcr-panel-primer-probes.html)
• Coronavirus (COVID-19) Update: Facilitating Diagnostic Test Availability for Asymptomatic Testing and Sample Pooling, (https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/ coronavirus-covid-19-update-facilitating-diagnostic-test-availabilityasymptomatic-testing-and)
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