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Total Protein Normalization - Stain Free Technology and Uvitec imagers

단백질 분석
작성일
2021-06-11 11:55
Total Protein Normalization
Stain-Free technology and Uvitec imagers

Introduction

Western blotting에서 internal control 로 사용되는 표적 단백질의 로딩은 매우 중요한 단계이며, 관찰된 loading variation이 샘플 간의 실제 차이를 나타내는 지 확인하는 과정이 필요합니다.
Housekeeping proteins은 일반적으로 Western blot normalization를 위한 loading control로 사용됩니다. 그러나 일부 실험 조건에서는 안정되게 발현하는 Housekeeping proteins을 검출하기가 쉽지 않습니다.
이럴 때는 Stain-free gel을 사용하여 정량화 된 각 샘플의 총 단백질 레벨에 대해 normalization 정도를 계산할 수 있습니다.

Experimental Conditions

배양된 astrocytes 에서 glutamate transporter GLT-1의 발현에 대한 beta-lactam 항생제의 효과를 검출하기 위해, 일정량의 세포(120.000 cells/well)를 DIV20에서 48시간 동안 항생제로 처리했습니다.
물에 용해된 항생제를 배양 배지 (DMEM-HAM F10, 10 % FBS, 1 % Pen / Strep)에 첨가했습니다.
Laemmli buffer (50μl/well)을 사용하여 astrocytes를 녹이고 95 °C에서 3분 동안 끓였습니다.
15 µg의 단백질에 상당하는 15 µl의 protein lysates를 4-15 % TGX Stain-free gel (B사 제품)에 로드하고 200V로 running 했습니다.
전기영동 분리 후 겔을 UV Transilluminator (HD6, UVITEC Ltd, UK)에 직접 놓고 60초 동안 활성화했습니다 (그림 1).
그런 다음 Trans-blot 장비를 사용하여 nitrocellulose membrane에 단백질을 blotting했습니다.



Image Of TGX Stain-Free Gel After UV Activation.
Samples are indicated upon each band. C=control, 10=10µM, 100=100µM, 500=500µM of the beta-lactam antibiotic.
After electrophoretic separation, the gel was directly placed on the UV-transilluminator (UVITEC Ltd, UK) and activated for 60 seconds.

Membranes 을 blocking solution (Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20 [TBS-T] and 5% non-fat dry milk)에서 1 시간 배양한 다음 anti-GLT1 1차 항체 (Santa)와 함께 4 °C에서 overnight 배양했습니다.
TBS-T에서 3번 세척한 후, blots은 anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody (1:10000 in 5% milk in TBS-T) 와 함께 실온에서 1시간 동안 배양되었고,
immunocomplexes는 ECL substrate kit를 처리한 후 ALLIANCE Q9(UVITEC Ltd, UK)을 사용해 시각화 되었습니다.
GLT-1 band 부피 측정은 UVITEC 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 값은 해당 TGX-stain lane 으로 normalized 되었습니다.
처리되지 않은 그룹 (대조군)의 평균값은 100%로 설정되었으며 데이터는 대조군의 백분율로 표시되었습니다.

Conclusion

선택된 beta-lactam 항생제는 배양된 astrocytes 에서 처리 용량에 따라 GLT-1의 발현을 증가시킵니다 (그림 2).


Chemiluminescence Signal Of GLT-1 After ECL Reaction.
Samples are indicated upon each band. C=control, 10=10µM, 100=100µM, 500=500µM of the beta-lactam antibiotic.
The selected beta-lactam antibiotic increases the expression of GLT-1 in cultured astrocytes in a dose-dependent manner.

*데이터 출처: Frasca A., Albizzati E., Dept. of Medical Biotechnology and Translational Medicine, L.I.T.A., University of Milan, Italy

Equipment

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Application

Chemiluminescence Western blotting
Chemiluminescent/ECL westerns, dot blots…
Fluorescence Optional DNA and RNA gels with fluorescent stains
Ethidium Bromide, GelRed, GelGreen, SYBR Safe & Green & Gold, Sypro Ruby, Emerald, Midori Green
Epi Fluorescence Optional IR/NIR/RGB multiplexing with up to 8 wavelengths
UV 365nm – TLC plates, Qdots…
Blue 420nm – DyLight 405, CFP, eCFP, Cerulean, Atto 425…
Blue 460nm – Cy2, GFP, eGFP, FITC, Alexa 488, Sypro, Bodipy…
Green 520nm – Cy3, Cy3.5, RFP, Alexa 532 & 568, Krypton …
Red 650nm – Cy5, Alexa 647, Atto 633, DyLight 633…
Red 690nm – Cy5.5 Atto 680, IRdye 680, Alexa 680, DyLight 680…
NIR 740nm – Cy7, Alexa 750, DyLight 750…
IR 780nm – IRdye 800, Alexa 790, DyLight 800
Bioluminescence In-vivo Luciferase and Fluorescence
Luciferin, fluorescent proteins (GFP, RFP, IRFP…), and stains
Visible Imaging Optional Colorimetry and Protein gels
Coomassie Blue, Cooper, Silver-stained, Red Ponceau, Petri Dish colonies & colony counting…
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