Application
Agarose gel electrophoresis (DNA 전기영동 )
실험기초
작성일
2021-06-07 14:35
Agarose Gel Electrophoresis
Introduction
DNA 전기영동은 크기, 전하 또는 구조가 다른 DNA 조각을 분리하는 기본적인 방법 입니다.
DNA는 구조상 Backbone의 Phosphate group을 가지고 있어 전기영동에 사용되는 Buffer안에서 음전하를 띄고 있으며,
두 전극 사이에 위치했을 때 (+)극으로 움직이는 기본적인 원리를 가지고 있습니다.
이때, Agarose나 Polyacrylamide와 같은 Gel Matrix 사이를 DNA 분자가 통과하는 속도는 분자량이 커질수록, Gel의 농도가 높을 수록 늦어지게 됩니다.
따라서 DNA ladder (알려진 길이의 DNA 단편 모음)와 함께 아가로스 젤에서 DNA 단편을 running 하여 DNA 단편의 대략적인 길이를 결정할 수 있습니다.
Protocol Video
> 참고 페이지: Addgene: Protocol - How to Run an Agarose Gel
Equipment
DNA Electrophoresis Tank
power supply
UV light source
Microwave
Reagents
TAE solution:
Agarose
Ethidum bromide (stock concentration of 10 mg/mL) or EtBr 대체 시약
Procedure
Pouring a Standard 1% Agarose Gel:
1. Measure 1 g of agarose.
Agarose 젤은 일반적으로 분리해야 하는 band의 크기에 따라 0.7 %~2 %의 농도로 사용됩니다.
주어진 부피에서 아가로스의 질량을 조정하여 다른 아가로스 농도의 젤을 만듭니다.
(예: TAE 100mL에 아가로스 2g을 넣으면 2 % 젤 완성).
2. 전자레인지 용 flasks 에서 agarose 분말을 100 mL 1xTAE와 혼합합니다. 다음 TAE 레시피를 참조하여 작업하십시오.
1L 50X stock of TAE
Tris-base: 242 g
Acetate (100% acetic acid): 57.1 ml
EDTA: 100 ml 0.5M sodium EDTA
Add dH2O up to 1L
To make 1x TAE from 50X TAE stock, dilute 20ml of stock into 980 ml of DI water
TBE를 TAE 대신 사용할 수 있으며, 실험실에서는 일반적으로 둘 중 하나를 사용합니다. TBE와 TAE는 차이가 거의 없지만,
버퍼는 혼합하여 사용하지 마십시오.
3. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 1~3 분 동안 전자레인지를 사용합니다.
일부 완충액이 증발하여 겔에서 아가로스의 최종 비율이 변경 될 수 있으므로 용액을 과도하게 끓이지 마십시오.
이때 폭발적으로 끓는 현상이 발생할 수 있으므로 주의하여 플라스크를 잘 저어 주십시오.
4. 약 5분 동안 정도 방치하여 아가로스 용액을 약 50 °C (손으로 플라스크를 편하게 잡을 수 있을 때)까지 식힙니다.
5. (선택사항) EtBr을 최종 농도 약 0.2-0.5μg/mL (일반적으로 100 mL 겔 당 약 2-3 μl)로 추가합니다.
EtBr은 DNA에 결합하여 자외선 (UV) 아래에서 DNA를 시각화 할 수 있습니다.
*주의: EtBr은 잘 알려진 돌연변이원입니다. 이 화학 물질로 작업 할 때는 실험복, 보안경 및 장갑을 반드시 착용하십시오.
6. well comb을 알맞은 자리에 놓고 아가로즈를 gel tray에 붓습니다.
거품이 발생하는 것을 방지하기 위해 천천히 부으십시오. comb이나 gel에 발생한 거품은 피펫 팁 등을 사용하여 가장자리로 밀어낼 수 있습니다.
7. 새로 부은 젤을 4 ° C에서 10-15분 동안 놓아 두거나 완전히 응고 될 때까지 실온에서 20-30 분 동안 그대로 두십시오.
급한 경우에는 gel tray를 4 °C 에 놓아두면 젤이 더 빨리 굳어지게 됩니다.
Loading Samples and Running an Agarose Gel:
1. loading buffer를 각 DNA samples에 추가합니다.
참고: loading buffer는 두 가지 용도로 사용됩니다.
1) 눈에 보이는 염료가 추가되어 있어 DNA가 얼마나 이동했는지 가늠할 수 있습니다.
2) DNA 샘플의 밀도를 증가시키는 글리세롤이 많이 함유되어 버퍼에서 확산되는 대신 well의 바닥에 가라앉도록 해줍니다.
2. 젤이 굳으면 아가로스 젤을 전기영동 장치의 gel box 넣습니다.
3. 젤이 덮일 때까지 gel box에 1xTAE (또는 TBE)를 채워줍니다.
젤에 EtBr을 추가한 경우 버퍼에도 EtBr을 추가합니다.
4. size marker를 첫번째 well 에 loading 합니다.
Well 밖으로 넘치지 않도록 주의합니다.
5. 샘플을 나머지 well 에 loading 합니다.
Well 밖으로 넘치지 않도록 주의합니다.
6. dye 라인이 젤 아래 방향으로 약 75-80% 지점에 떨어질 때까지 80-150V로 전기영동 장비를 작동시킵니다.
일반적인 running time은 젤 농도 및 전압에 따라 약 1-1.5시간입니다.
7. running이 완료되면 전원을 끄고 전극을 분리한 다음 gel box에서 조심스럽게 젤을 제거합니다.
8. (선택사항) 겔과 버퍼에 EtBr을 첨가하지 않은 경우, TAE 버퍼 100 mL와 EtBr 5 μL를 채운 용기에 겔을 넣고,
rocker에 20~30분간 둔 다음에 EtBr 용액을 dw로 교체하고 5분간 두어 destain해 줍니다.
9. UV Transilluminator나 gel imaging systems을 이용하여 겔 상에 DNA fragments를 관찰합니다.
EtBr 대체 시약을 사용했을 경우 파장이 맞는 LED Transilluminator 를 사용합니다.
자외선을 사용할 때는 보안경이나 안면 보호대, 장갑 및 실험실 가운을 착용하여 눈과 피부를 보호하십시오.
Loading Samples and Running an Agarose Gel:
첫 번째 lane 의 DNA marker 를 기준으로 샘플의 DNA 크기를 유추할 수 있습니다.
Purifying DNA from Your Gel:
원하는 사이즈의 DNA를 찾았다면 purification step 이나 gel extraction step 을 거쳐 PCR 등의 실험에 활용하면 됩니다.
Tips and FAQ
How do you get better resolution of bands?
DNA band 의 분해능을 증가시키는 몇 가지 간단한 방법에는 a) 더 낮은 전압에서 더 긴 시간 동안 구동하거나,
b) 더 넓고 얇은 gel comb 사용하거나, 또는 c) well에 더 적은 DNA를 loading하는 방법이 있습니다.
매우 짧은 DNA 조각을 시각화하는 또 다른 방법은 PAGE (polyacrylamide gel Electrophoresis)로,
일반적으로 5 - 500bp 내의 fragments를 분리하는 데 사용됩니다.
How do you get better separation of bands?
비슷한 크기의 DNA band가 너무 가까이 붙어 있는 경우 젤의 agarose 농도를 조절하여 더 나은 분리를 할 수 있습니다.
아가로오스 젤의 비율이 높으면 작은 밴드를 분리하는데 도움이 되며, 낮은 비율의 젤은 큰 밴드를 분리하는 데 도움이 됩니다.
10% Rule:
Loading을 위한 피펫팅에서 어느 정도 샘플이 손실 될 수 있으므로 각 샘플에 대해 젤에 로드하려고 하는 필요량보다 10% 정도 더 많은 볼륨을 만드는 것이 좋습니다.
예를 들어, 10μL에 1.0 μg를 로드하려면 11 μL에 1.1 μg를 만드는 것을 추천 드립니다.
Related Products
HiQ Agarose
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/agarose/
HiQ DNA Marker
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/dna-marker/
HiQ Blue Mango
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/blue-mango/
XinDNA Horizontal Electrophoresis Tank
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/horizontal-tank/
Ultraviolet transilluminators
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/uvivue/
BLUPAD
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/blupad/
Gel Imaging System
http://www.biod.co.kr/portfolio_category/gel-imaging-system/
Introduction
DNA 전기영동은 크기, 전하 또는 구조가 다른 DNA 조각을 분리하는 기본적인 방법 입니다.
DNA는 구조상 Backbone의 Phosphate group을 가지고 있어 전기영동에 사용되는 Buffer안에서 음전하를 띄고 있으며,
두 전극 사이에 위치했을 때 (+)극으로 움직이는 기본적인 원리를 가지고 있습니다.
이때, Agarose나 Polyacrylamide와 같은 Gel Matrix 사이를 DNA 분자가 통과하는 속도는 분자량이 커질수록, Gel의 농도가 높을 수록 늦어지게 됩니다.
따라서 DNA ladder (알려진 길이의 DNA 단편 모음)와 함께 아가로스 젤에서 DNA 단편을 running 하여 DNA 단편의 대략적인 길이를 결정할 수 있습니다.
Protocol Video
> 참고 페이지: Addgene: Protocol - How to Run an Agarose Gel
Equipment
DNA Electrophoresis Tank
power supply
UV light source
Microwave
Reagents
TAE solution:
Agarose
Ethidum bromide (stock concentration of 10 mg/mL) or EtBr 대체 시약
Procedure
Pouring a Standard 1% Agarose Gel:
1. Measure 1 g of agarose.
Agarose 젤은 일반적으로 분리해야 하는 band의 크기에 따라 0.7 %~2 %의 농도로 사용됩니다.
주어진 부피에서 아가로스의 질량을 조정하여 다른 아가로스 농도의 젤을 만듭니다.
(예: TAE 100mL에 아가로스 2g을 넣으면 2 % 젤 완성).
2. 전자레인지 용 flasks 에서 agarose 분말을 100 mL 1xTAE와 혼합합니다. 다음 TAE 레시피를 참조하여 작업하십시오.
1L 50X stock of TAE
Tris-base: 242 g
Acetate (100% acetic acid): 57.1 ml
EDTA: 100 ml 0.5M sodium EDTA
Add dH2O up to 1L
To make 1x TAE from 50X TAE stock, dilute 20ml of stock into 980 ml of DI water
TBE를 TAE 대신 사용할 수 있으며, 실험실에서는 일반적으로 둘 중 하나를 사용합니다. TBE와 TAE는 차이가 거의 없지만,
버퍼는 혼합하여 사용하지 마십시오.
3. 아가로스가 완전히 용해될 때까지 1~3 분 동안 전자레인지를 사용합니다.
일부 완충액이 증발하여 겔에서 아가로스의 최종 비율이 변경 될 수 있으므로 용액을 과도하게 끓이지 마십시오.
이때 폭발적으로 끓는 현상이 발생할 수 있으므로 주의하여 플라스크를 잘 저어 주십시오.
4. 약 5분 동안 정도 방치하여 아가로스 용액을 약 50 °C (손으로 플라스크를 편하게 잡을 수 있을 때)까지 식힙니다.
5. (선택사항) EtBr을 최종 농도 약 0.2-0.5μg/mL (일반적으로 100 mL 겔 당 약 2-3 μl)로 추가합니다.
EtBr은 DNA에 결합하여 자외선 (UV) 아래에서 DNA를 시각화 할 수 있습니다.
*주의: EtBr은 잘 알려진 돌연변이원입니다. 이 화학 물질로 작업 할 때는 실험복, 보안경 및 장갑을 반드시 착용하십시오.
6. well comb을 알맞은 자리에 놓고 아가로즈를 gel tray에 붓습니다.
거품이 발생하는 것을 방지하기 위해 천천히 부으십시오. comb이나 gel에 발생한 거품은 피펫 팁 등을 사용하여 가장자리로 밀어낼 수 있습니다.
7. 새로 부은 젤을 4 ° C에서 10-15분 동안 놓아 두거나 완전히 응고 될 때까지 실온에서 20-30 분 동안 그대로 두십시오.
급한 경우에는 gel tray를 4 °C 에 놓아두면 젤이 더 빨리 굳어지게 됩니다.
Loading Samples and Running an Agarose Gel:
1. loading buffer를 각 DNA samples에 추가합니다.
참고: loading buffer는 두 가지 용도로 사용됩니다.
1) 눈에 보이는 염료가 추가되어 있어 DNA가 얼마나 이동했는지 가늠할 수 있습니다.
2) DNA 샘플의 밀도를 증가시키는 글리세롤이 많이 함유되어 버퍼에서 확산되는 대신 well의 바닥에 가라앉도록 해줍니다.
2. 젤이 굳으면 아가로스 젤을 전기영동 장치의 gel box 넣습니다.
3. 젤이 덮일 때까지 gel box에 1xTAE (또는 TBE)를 채워줍니다.
젤에 EtBr을 추가한 경우 버퍼에도 EtBr을 추가합니다.
4. size marker를 첫번째 well 에 loading 합니다.
Well 밖으로 넘치지 않도록 주의합니다.
5. 샘플을 나머지 well 에 loading 합니다.
Well 밖으로 넘치지 않도록 주의합니다.
6. dye 라인이 젤 아래 방향으로 약 75-80% 지점에 떨어질 때까지 80-150V로 전기영동 장비를 작동시킵니다.
일반적인 running time은 젤 농도 및 전압에 따라 약 1-1.5시간입니다.
7. running이 완료되면 전원을 끄고 전극을 분리한 다음 gel box에서 조심스럽게 젤을 제거합니다.
8. (선택사항) 겔과 버퍼에 EtBr을 첨가하지 않은 경우, TAE 버퍼 100 mL와 EtBr 5 μL를 채운 용기에 겔을 넣고,
rocker에 20~30분간 둔 다음에 EtBr 용액을 dw로 교체하고 5분간 두어 destain해 줍니다.
9. UV Transilluminator나 gel imaging systems을 이용하여 겔 상에 DNA fragments를 관찰합니다.
EtBr 대체 시약을 사용했을 경우 파장이 맞는 LED Transilluminator 를 사용합니다.
자외선을 사용할 때는 보안경이나 안면 보호대, 장갑 및 실험실 가운을 착용하여 눈과 피부를 보호하십시오.
Loading Samples and Running an Agarose Gel:
첫 번째 lane 의 DNA marker 를 기준으로 샘플의 DNA 크기를 유추할 수 있습니다.
Purifying DNA from Your Gel:
원하는 사이즈의 DNA를 찾았다면 purification step 이나 gel extraction step 을 거쳐 PCR 등의 실험에 활용하면 됩니다.
Tips and FAQ
How do you get better resolution of bands?
DNA band 의 분해능을 증가시키는 몇 가지 간단한 방법에는 a) 더 낮은 전압에서 더 긴 시간 동안 구동하거나,
b) 더 넓고 얇은 gel comb 사용하거나, 또는 c) well에 더 적은 DNA를 loading하는 방법이 있습니다.
매우 짧은 DNA 조각을 시각화하는 또 다른 방법은 PAGE (polyacrylamide gel Electrophoresis)로,
일반적으로 5 - 500bp 내의 fragments를 분리하는 데 사용됩니다.
How do you get better separation of bands?
비슷한 크기의 DNA band가 너무 가까이 붙어 있는 경우 젤의 agarose 농도를 조절하여 더 나은 분리를 할 수 있습니다.
아가로오스 젤의 비율이 높으면 작은 밴드를 분리하는데 도움이 되며, 낮은 비율의 젤은 큰 밴드를 분리하는 데 도움이 됩니다.
10% Rule:
Loading을 위한 피펫팅에서 어느 정도 샘플이 손실 될 수 있으므로 각 샘플에 대해 젤에 로드하려고 하는 필요량보다 10% 정도 더 많은 볼륨을 만드는 것이 좋습니다.
예를 들어, 10μL에 1.0 μg를 로드하려면 11 μL에 1.1 μg를 만드는 것을 추천 드립니다.
Related Products
HiQ Agarose
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/agarose/
HiQ DNA Marker
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/dna-marker/
HiQ Blue Mango
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/blue-mango/
XinDNA Horizontal Electrophoresis Tank
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/horizontal-tank/
Ultraviolet transilluminators
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/uvivue/
BLUPAD
http://www.biod.co.kr/portfolio-items/blupad/
Gel Imaging System
http://www.biod.co.kr/portfolio_category/gel-imaging-system/
전체 0