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Digital PCR의 원리와 활용분야

Digital PCR
작성일
2021-05-28 18:18
Digital PCR의 원리

Digital PCR은 PCR 반응액 안에 DNA가 한 개 정도가 들어가도록 충분히 희석하여 여러 번 증폭반응을 반복한 후, 증폭이 일어난 양성반응 횟수를 확인 하여 target nucleic acid의 양을 측정하는 방법이다. 따라서 검출감도가 높은 digital PCR 결과를 얻기 위해서는 수 천 개에서 수 만개의 PCR 반응액이 요구된다. Nano-liter 수준의 PCR이 가능한 여러 다양한 nano-fluidic PCR 기술을 적용하여 발전한 PCR기술이 Digital PCR이다. PCR 반응액을 만들어서 작은 partition으로 구성된 chip으로 분주하여 수 천에서 수 만개의 PCR 반응을 동시에 진행하여 positive 횟수를 측정하여 정량 하게 된다.



Clarity Digital PCR System의 특징



partition으로 구성된 chip을 기반으로 한 chip-in-atube 방식을 이용하여 사용이 편리하다. 각 PCR mix는 신속하게 10,000 ~40,000개의 partition으로 구성된 high-density chip 안으로 나뉘어 들어간다. Partitioning 작업은 1분 내에 완료 된다. Auto-loader를이용하기 때문에 loading이 쉽고, 실험자의 pipetting error 를 줄일 수 있으며, 이러한 과정 중에 발생할수 있는 cross  contamination을 줄일 수 있다. Chip column 에 공기방울이 형성되어 template가 증폭되지 않는 현상을 최소화했으며, sealing enhancer를 사용하여 PCR 반응이 일어나는 동안 증발 등의 영향을 방지할 수 있다.

Digital PCR Workflow : faster and easier

 



1) Total 15ul의 PCR Mix를 준비한다.
2) Clarity auto loader를 이용하여 nano 사이즈의 10,000개의 partition에 동일하게 자동으로 분주한 후 sealing enhancer를 이용하여 봉한다.
3) tube의 cover를 덮고 PCR 증폭을 실시한다.
4) Clarity TM Digital PCR System을 이용하여 Positive reaction의 형광신호를 감지한 후, target DNA의 절대값을 계산한다.

Digital PCR의 응용

Digital PCR은 매우 정확하고 감도가 높은 방법으로 DNA나 RNA를 정성적/정량적 분석을 하기 때문에 최근 그 수요와 응용분야가 급격히 늘어나고 있다.
Real-Time PCR에 비해 민감도, 정확도, 특이도가 높은 장점을 가지고 있다. 따라서 체세포 돌연변이, GMO와 같은 응용에 적합한 기술이다. human gDNA, bacterial DNA, NGS library의 정량에도 사용될 수 있다. 또한 FAM과 VIC/HEX 의 두 채널을 이용하여 형광을 검출할 수 있기 때문에 copy number variation (CNV) analysis나 rare mutation detection 등에 다양하게 적용될 수 있다.

1. Real-Time PCR과 Digital PCR의 절대 정량 비교

Real-Time PCR로 절대 정량을 하기 위해서는 절대 값을 이미 알고 있는 표준시료를 이용하여 standard curve를 그리고 정량하고자 하는 sample 의 Ct값을 standard curve에 대입하여 정량을 하게 된다. 따라서 Standard curve의 quality가 매우 중요하며, PCR 효율에 영향을 주는 assay chemistry, inhibitor 등에 영향을 받을 수 있다. High throughput, routine한 실험에 적합한 방법이다. Digital PCR은 positive reaction을 counting하는 방식으로 정량 하기 때문에 표준시료나 대조군이 필요 없고, PCR효율이나 inhibitor의 영향을 비교적 적게 받는다. 높은 정확도와 민감도를 필요로 하는 실험에 적합하다.

그림1. Absolute quantification of human gDNA

2. Real-Time PCR과 Digital PCR의 rare allele detection 비교

Rare allele 검출 시험에서 Real-Time PCR은 하나의 PCR 반응액 안에 다수의 wild type과 rare allele이섞여 PCR이 진행되므로, 상대적으로 수가 적은 rare allele의 PCR inhibition의 영향을 받거나 PCR 신호가 낮게 detection된다. 그러나 Digital PCR은 각각의 target DNA가 서로 독립된 PCR 반응액에서 PCR 이 이루어지므로 wild type이 다수로 존재하더라도 rare allele에 영향을 주지 않게 되고, PCR 증폭 신호도 동일하게 된다. Digital PCR은 Real-time PCR에비하여 specificity가 높은 장점이 있다.


표1. Different mutant fractions of BRAF V600E mutations.
Analyzed using FAM (mutant)- and VIC (wildtype)-labeled Taqman® probes.

3. Digital PCR에서의 유전자 정량 (상대 정량)

Digital PCR에서의 정량은 포아송 분포라는 통계 분석 방법을 통해 이루어진다. 포아송 분포란 일정한 시간과 공간 내에서 발생하는 사건의 발생횟수, 그에 따른 확률을 구하게 된다. 따라서 PCR 반응이 일어나면, 이것이 포아송 분포를 통해 분석되어 positive와 negative의 비율을 구하게 된다. 예를 들어 Digital PCR Mix에 약 1,000 개의 copy 수가 있다고 가정을 한다. 이 때, 시약과 DNA Mix는 1,000 개로 나누어져 반응이 이루어지거나 혹은 연구자가 선택한 반응 개수로 나누어져 Real-Time PCR이 진행되게 되고 데이터가 수집된다. 이론적으로 하나의 반응에서는 1개의 copy수가 나타나지만, 다수의 반응에서 copy수가 발견되지 않거나 혹은 2개, 혹은그 이상의 copy수가 나올 수가 있다. 포아송 분포는 계산 방식이 퍼센트에 기본을 두게 되며, 발견된 총 copy만 의미가 있을 뿐, 얼마나 많은 반응을 하였는 지는 고려하지 않는 개념이기 때문에 이러한 가능 성을 포아송 분포를 통해 확인할 수 있다.



4. Single cell analysis

Real-Time PCR은 하나의 세포를 이용한 경우 한번에 많은 샘플을 처리할 수 있으며 적은 비용으로도 실험이 가능하지만 기본적으로 pre-amplification 과정이 필요하다. 그러나 Digital PCR을 이용한 경우, 민감도가 높고 절대 정량이 가능하기 때문에 preamplification과정이 필요 없다.

5. Copy number variation

TaqMan® Assay를 이용한 Real-Time PCR 방법과 Digital PCR 모두 copy 수의 변화를 확인할 수 있다.
그러나 Digital PCR은 기존의 Real-Time PCR보다 더정확한 실험 결과를 보여준다.

6. 아주 낮은 농도의 pathogen 검사

대다수의 pathogen 검사에서 Digital PCR이 RealTime PCR에 비해 더 확실한 결과를 보여주며 비용 역시 적게 든다.

7. 바이러스의 표준 시료

바이러스 연구에서는 Real-Time PCR에서 상대정량을 하기 위해서 표준시료나 대조군을 사용한다. 하지만 몇몇 경우 바이러스 표준 시료를 사용할 수없는 경우가 발생할 수 있다. Digital PCR은 준비한 RNA를 cDNA로 바꾸어 바로 정량이 가능하기 때문에 표준시료나 대조군을 제작할 수 있다.


8. NGS library 정량

Digital PCR을 사용하여 표준곡선을 생성하지 않아도 절대 정량이 가능하다. 정확한 정량을 위해서 각 library에 특정한 forward와 reverse adapter 양쪽에 사용가능한 assay방법을 이용한다. 궁극적으로 NGS library를 정량하는 Digital PCR을 사용하여 샘플의 순서를 반복하거나 재실행하는 선행과정을 최소화 하여 전체 시퀀싱 비용을 감소시킨다.


그림3. EvaGreen-based Digital PCR assay 사용 – Illumina NGS library 정량, Adapter P5와 P7을 타겟으로 하는 프라 이머를 이용하여 452bp amplify

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• Cell-free nucleic acid analysis
• Quantification reference materials
• Copy number variant analysis
• Bacterial / Viral load quantification
• Next-generation sequencing (NGS) applications
• Minimum Sample Loss
• Fast Turnaround Time
• Ability to design your own assay
• SNP quantification
• Rare variant detections
• Genomic alterations
• Gene expression analysis
• Digital PCR assay customization
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