Application

Mosquito DNA Extraction and High Throughput Gene Targeting on Bead Ruptor 96 Bead Mill Homogenizer

핵산추출
작성일
2021-05-10 18:48
Introduction

모기, 특히 Aedes aegypti는 황열병, 뎅기열, 지카와 같은 벡터 매개 질병의 숙주 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 벡터 매개 질병의 확산을 모니터링하기 위해 연구자들은 일반적으로 현장에서 모기를 샘플링하고 유기체를 분리하여 내부 병원체를 방출하여 병원체를 정량화합니다. 연구자들이 높은 수준의 벡터 및 병원균 분리율울 유지하면서 많은 수의 모기를 신속하게 분리하기 위해서는 빠르고 정확한 샘플링 기술이 필요합니다. 여기에서, 우리는 endpoint PCR에 의한 DNA 정제 및 분석을 위해 Bead Ruptor96 Bead Mill Homogenizer 를 사용하게 됩니다.

Goal
DNA was extracted from mosquitos to be used for PCR using the Bead Ruptor 96.

Materials and Methods

Multiple mosquito DNA extractions in 1.5 ml tubes

DNA 추출을 위해, 해동된 모기 50mg을 3.5ml tube에 3개의 2.4mm stainless steel beads와함께 넣은 다음, 350µl CTL 버퍼를 추가하고, Bead Ruptor 96을 이용해 30Hz에서 3분간 균질화 하였습니다. 그후 Insect kit를 이용하여 DNA를 정제한 후 -20°C에 저장하였습니다. DNA는 Bio fragment analyzer를 이용하여 정량 및 분석되었으며, 18S rRNA와 Aedesserine protease 유전자인 Serpin 5b를 사용하여 end point PCR을 수행하였습니다.

Single mosquito DNA extraction in 96 well plates

모기 한 마리를 해동하여 2.4mm stainless steel beads와 함께 2mL 96 deep well plate에 놓고, 1 mL of 0.3 M sucrose, 0.3 M NaCl, and 60 mM of Tris-HCl, pH 7.4를 첨가한 다음 플레이트를 silicone mat로 밀봉 하였습니다. 그 다음 샘플을 Bead Ruptor 96을 이용하여 24Hz에서 5분 동안 균질화 했습니다. 처리 후 96well plate를 water bath에서 10 분 동안 95 ° C로 가열한 후 4000rpm에서 5 분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠렛 화하고 5 분 동안 얼음 위에 두었습니다. 고농도의 sucrose에서 처리함으로써 DNA는 튜브 상단에 cellular debris는 하단으로 분할되게 됩니다. 상단에서 1 µL의 DNA를 따서 end point PCR로 분석하였습니다.

DNA Quantification

추출된 50mg의 DNA를 Nanodrop 을 이용하여 세번에 걸쳐 정량화 하였습니다. 1μl의 DNA를 Bioanalyzer에서 다시 세번에 걸쳐 추가 분석했습니다 (그림 1).

Endpoint PCR

추출된 DNA를 1pg / µL로 희석하고 PCR 반응을 진행하였습니다. 프라이머 (표2)는 Aedes aegypti serine protease 유전자 Serpin 5b를 타게팅하여 디자인했습니다. 콘트롤은 정제된 S. cerevisiae DNA 1pg였습니다. PCR은 30 초 동안 95 ° C, 30 초 동안 50.8 ° C, 30 초 동안 72 ° C, 30 초 동안 95 ° C 에서 30회 순환하도록 설정되었습니다. 생성된 amplicons은 2 % 아가로스 겔에서 확인하였습니다. 모든 amplicons을 TBE-urea로 1:1 희석하고 전기 영동을 140V에서 1 시간 동안 수행했습니다. 전기 영동 후, Gel imaging system에서 이미징 한 후 0.05 % ethidium bromide로 20분 동안 염색하여 amplicons을 시각화 했습니다.

Results

모기의 Field sampling 에 이은 DNA 정제는 벡터 매개 질병의 확산을 조사하기 위한 일반적인 처리 과정입니다. 샘플 크기가 상대적으로 작고 샘플 수가 많기 때문에 beads를 이용한 균질화가 처리량이 많은 샘플의 처리를 위한 이상적인 방법입니다. 2개의 96 well plate로 작동 시킬 경우 Bead Ruptor 96을 사용하면 liquid handling systems과 호환되는 SBS format으로 최대 192 개의 샘플을 동시에 처리 할 수 있습니다. 여기에서는 두 가지 다른 접근 방식을 사용하여 DNA 추출 방법을 보여줍니다. 첫 번째는 실리카 스핀 컬럼 기반 DNA 추출 방법과 결합 된 여러 마리의 모기 (50mg)를 사용했으며 두 번째 방법은 한마리의 모기에서 PCR에 적합한 DNA를 추출하는 방법을 보여주었습니다.

표 1과 그림 1은 50mg의 모기를 모아 실리카 스핀 컬럼 정제에서 얻은 DNA의 수율과 무결성을 보여줍니다. 260/280 비율은 2.04로 관찰되어 RNA와 함께 정제되었음을 보여줍니다. Bioanalyzer 분석은 대부분의 정제된 DNA가 3000-6000 염기쌍 범위에 있음을 나타냅니다.
Table 1: DNA quantification and purity analysis by spectrophotometry using DNA purified from 50 mg of Aedes aegypti.
Table 2: Primers ordered from IDT for each gene target.
Figure 1: Bioanalyzer generated electropherogram resulting from the analysis of purified DNA obtained from 50 mg of Aedes aegypti.
정제된 DNA는 18S rRNA 및 Aedes sserine protease 유전자 인 Serpin 5b를 표적으로 하는 endpoint PCR에 의해 추가로 분석되었습니다.
50mg 모기 추출의 경우 18S 및 Serpin 5b PCR 모두에서 풍부한 amplicons이 관찰되었습니다.
단일 모기 DNA 정제의 경우 18S amplicons이 검출되었지만 Serpin 표적 PCR은 검출 가능한 결과를 얻지 못했습니다.
이것은 아마도 단일 유기체에서 얻은 DNA의 농도가 낮기 때문일 것입니다.
Figure 2: PCR products targeting 18S and serpin 5b from the 50 mg mosquito extraction.
Extracted DNA was capable of being amplified by both species-specific primers (Serpin 5b) and eukaryotic specific primers (18s ribosomal subunit).
PC indicates positive control.
Figure 3: PCR products targeting 18S and serpin 5b from the single mosquito extraction.
Extracted DNA was capable of being amplified for the eukaryotic specific primers (18s ribosomal subunit).
PC indicates positive control.

References


Mousson, L., Dauga, C., Garrigues, T., Schaffner, F., Vazeille, M., & Failloux, A. (2005). Phylogeography of Aedes (Stegomyia) aegypti (L.) and Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae) based on mitochondrial DNA variations. Genetical Research, 86(1), 1-11.

Lars Eisen, Chester G. Moore; Aedes (Stegomyia) aegypti in the Continental United States: A Vector at the Cool Margin of Its Geographic Range, Journal of Medical Entomology, Volume 50, Issue 3, 1 May 2013, Pages 467–478,

Equipment

The Bead Ruptor 96 is capable of performing all milling applications
Traditional milling, cryo-milling, well plate and tube-based bead homogenizing 과정을 하나의 bench-top 장비에서 수행할 수 있습니다.
  • Bead Ruptor 96 (Cat# 27-0001) 상세보기
  • Bead Ruptor 96 Microtube Holder (Cat# 27-106)
  • 1.5 mL Pre-filled Tube with 2.4 mm Metal Beads (Cat# 19-610)
  • 2 mL 96 Deep Well Plate (Cat# 27-500)
  • Deep Well Plate Sealing Mat (Cat# 27-510)

Application

  •  Insects
  • Dry grinding of grains
  • Powder particle size reduction
  • Dissociation of plastics
  • Plants
  • Seeds
  • Paper Products
  • Drugs
Tags
Bead Ruptor 96, mosquitos, DNA, PCR, gene targeting
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