Application
순도 높은 DNA를 고수율로 추출하기 위한 최적의 프로토콜
핵산 추출
작성일
2022-06-17 15:46
A Robust and High Yield DNA Extraction Protocol from Bovine Liver Utilizing the OMNI Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer in Combination with Automated Extraction on the Nucleic Acid Extractor
Madelyn M Carlson; Caleb M Proctor, M.S., Zachary P Morehouse, D.O., M.S.; Rodney J Nash, Ph.D., OMNI International, a PerkinElmer company
Summary
현 시점에서 분자생물학적 분석을 위한 인간 및 동물 조직 샘플의 처리는 다양한 분야에 걸친 연구의 초석이 되고 있습니다.
특히, 간 샘플과 같은 연조직의 처리는 약물 개발 분야에서 발생학 및 줄기세포의 발달을 검사하는 해부학 분야에 이르기까지 모든 과정에 매우 중요합니다.
연구자는 핵산 추출 과정을 통해 잘 처리되어 준비된 샘플에서 높은 품질의 DNA 또는 RNA를 준비할 수 있습니다.
핵산 추출의 중요한 구성 요소는 조직 표본이 분리되고 세포가 용해되어 유전 물질이 노출되는 첫 단계에서 부터 제대로 된 샘플을 준비하는 것입니다.
조직 샘플을 준비하는 방법은 여러 가지가 있지만 재현성이 높은 것으로 입증된 한 가지 방법은 bead mill homogenization 통한 기계적인 용해법입니다.
조직을 기계 장비를 이용해 균질화 하면 다음 단계의 실험을 준비하기 위해 일관되고 균일한 샘플 균질액을 준비할 수 있습니다.
핵산 추출 워크플로에서 똑같이 중요한 것은 고품질의 핵산 추출 재현성입니다.
자동화는 이러한 워크플로우의 재현성을 크게 개선하여 사람에 의해 발생하는 오류를 대폭 줄이고 정확한 프로토콜 수행을 보장할 수 있습니다.
현재 핵산 추출 자동화 분야에서 사용되는 기술 중 하나는 자기 비드 기술을 활용하는 것입니다.
이러한 장비를 사용하면 완전히 자동화된 핵산 추출 프로세스가 가능합니다.
그 결과 정제된 핵산은 PCR 또는 NGS과 같은 다양한 downstream application에 바로 활용할 수 있습니다.
그러나 자동화된 핵산 추출 프로토콜도 여전히 일련의 과정을 진행하기 전에 샘플을 먼저 준비해야 합니다.
보통 10mg 이하의 조직과 샘플 유형에 따라 적당한 시약을 추가합니다.
자동화된 추출 이전의 샘플 준비 단계는 특히 연구자에 의한 오류를 조심해야 합니다.
일관된 조직 용해액을 얻기 위해 Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer를 사용한 재현 가능한 기계적 용해를 제안합니다.
여기에서 OMNI Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer와 핵산추출장비를 함께 사용하여 강력하고 재현 가능한 워크플로우를 통해 소의 간 샘플에서 높은 품질과 양의 DNA를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
이 프로토콜은 enzymatic lysis와 비교하여 완전한 샘플 균질화 및 재현성에 중점을 둔 핵산추출 과정이라 할 수 있습니다.
Materials and Methods
• Bead Ruptor Elite (Cat # 19-042E)
• 2 mL Tube Carriage (Cat # 19-373)
• Finger Plate (Cat # 19-370)
• 2 mL Hard Tissue Homogenizing Mix 2.8 mm Ceramic Beads (Cat # 19-628)
Procedure
세라믹 비드 (OMNI, Cat #19-628)가 미리 채워진 32개의 2mL 튜브에 750µL의 조직 용해 완충액을 채웠습니다.
소의 간 약 5g을 -20°C에서 보관한 후 해동했습니다. 그런 다음 이 간을 수동절개를 통해 100g(+/- 1g) 샘플로 분할했습니다.
각 샘플을 미리 준비된 2mL 튜브에 넣고 여기에 18µL의 Proteinase K와 7.5µL의 RNase A를 추가하였습니다.
모든 튜브는 30초 동안 5m/s의 속도로 Bead Ruptor Elite를 사용하여 처리되었습니다.
처리 후, 튜브를 9,000rpm에서 10분 동안 원심분리 했습니다. 원심분리 후 모든 튜브를 37°C에서 30분 동안 인큐베이션 했습니다.
인큐베이션 후 200μL의 각 샘플을 3중으로 2mL plate 에 로딩 했습니다.
그런 다음 이 플레이트를 핵산추출장비에 로장착하고 표준 프로토콜을 실행했습니다.
프로토콜을 완료한 후 플레이트의 각 처리된 샘플에서 생성된 DNA를 Nanodrop을 통해 정량화 했습니다.
추출된 DNA의 총 수율과 A260/A280 비율을 기록하여 샘플의 양과 품질을 평가했습니다.
이 프로세스는 3번에 걸쳐 별도로 수행되었으며 재현성을 평가하기 위해 2-tailed paired t-test를 통해 통계적으로 서로 결과를 비교 하였습니다.
Results
세 번의 시도에서 얻은 핵산 농도는 평균을 내고 NanoDrop에 기록되었으며 농도는 각각 102.86, 101.81 및 100.68ng/µL입니다.
그런 다음 전체 모집단에 걸쳐 표준 편차를 결정하고 각 테스트 날짜의 해당 값에서 RSD(상대 표준 편차) 값을 도출하여 RSD가 각각 10, 14 및 12%가 되었습니다.
각 실행의 평균 값은 two-tailed paired t-test를 사용하여 분석되었습니다.
t-test는 p값이 0.7, 0.4, 0.7인 테스트 1 vs 2, 1 vs 3, and 2 vs 3 간에 유의한 차이를 보이지 않았습니다.
나노드롭으로 측정한 모든 샘플의 평균 A 260/A 280 비율은 1.78인 것으로 나타났습니다.
이것은 일반적인 프로토콜에 따른 고품질 또는 "순수한" DNA의 권장 값입니다.
이와 같은 고품질 DNA는 다운스트림 애플리케이션에서 보다 정확한 결과를 생성하는 데 도움이 됩니다.
Figure 1. Average Nucleic Acid Concentration per Trial as shown in ng/µL. Each trial had the complete concentrations averaged and statistically evaluated as discussed in the methods section.
Conclusion
여기에서 냉동된 소의 간 샘플에서 정제된 DNA를 얻을 때 제안된 추출 워크플로의 3번에 걸친별도의 추출 실험 사이에 유의미한 차이 (p<.05)가 발견되지 않았습니다.
이 데이터를 기반으로 Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer와 Nucleic Acid Extractor의 조합이 downstream genome application을 위한 재현성이 높은 워크플로임을 보여줍니다.
Bead Ruptor Elite와 자동핵산추출장비를 통합하여 훨씬 더 큰 샘플을 고품질 DNA로 처리할 수 있고, 샘플 준비 시간을 절약하고 더 다양한 샘플을 처리할 수 있으며 추출된 핵산의 품질을 보장할 수 있습니다.
Equipment
Bead Ruptor Elite 제품 상세정보 보러가기
•다양하고 견고한 Carriages : 0.5ml screw cap tube ~ 50mL tubes
•독창적인 3D shaking 방식
•터치스크린 인터페이스와 99개의 프로토콜 저장
•안전한 이중 잠금 장치
•편리한 전면 샘플 장착 방식과 온도 센서 내장으로 실험과정 모니터링이 쉬움
•최대 8m/s의 속도로 튜브 모션 최적화
SpinPrep96, Nucleic acid Extractor < 제품 상세 정보 보러가기
• 전, 후 처리 과정이 필요 없는 간편한 실험 과정 (Lysis에서 elution까지 한번에 진행)
• 최대 96개 Sample 추출을 약 20분 이내에 완료 가능
• 오염 방지를 위한 UV Lamp 내장
• Heat block 장착으로 Lysis 및 Elution 시 고수율 및 고순도 보장
• 각 시료에 따른 최적화 된 protocol 제공
Tags
Bovine, Liver, Bead Mill, animal tissue, animal tissue, homogenizer, 호모게나이저, 호모지나이저, 균질기, 파쇄기, 균질화기기, 샘플균질기, 시료균질기, 비드럽터, 핵산추출기, 자동핵산추출장비,자동전처리장비, nucleic acid, DNA, RNA, magnetic beads, PCR, qPCR
Madelyn M Carlson; Caleb M Proctor, M.S., Zachary P Morehouse, D.O., M.S.; Rodney J Nash, Ph.D., OMNI International, a PerkinElmer company
Summary
현 시점에서 분자생물학적 분석을 위한 인간 및 동물 조직 샘플의 처리는 다양한 분야에 걸친 연구의 초석이 되고 있습니다.
특히, 간 샘플과 같은 연조직의 처리는 약물 개발 분야에서 발생학 및 줄기세포의 발달을 검사하는 해부학 분야에 이르기까지 모든 과정에 매우 중요합니다.
연구자는 핵산 추출 과정을 통해 잘 처리되어 준비된 샘플에서 높은 품질의 DNA 또는 RNA를 준비할 수 있습니다.
핵산 추출의 중요한 구성 요소는 조직 표본이 분리되고 세포가 용해되어 유전 물질이 노출되는 첫 단계에서 부터 제대로 된 샘플을 준비하는 것입니다.
조직 샘플을 준비하는 방법은 여러 가지가 있지만 재현성이 높은 것으로 입증된 한 가지 방법은 bead mill homogenization 통한 기계적인 용해법입니다.
조직을 기계 장비를 이용해 균질화 하면 다음 단계의 실험을 준비하기 위해 일관되고 균일한 샘플 균질액을 준비할 수 있습니다.
핵산 추출 워크플로에서 똑같이 중요한 것은 고품질의 핵산 추출 재현성입니다.
자동화는 이러한 워크플로우의 재현성을 크게 개선하여 사람에 의해 발생하는 오류를 대폭 줄이고 정확한 프로토콜 수행을 보장할 수 있습니다.
현재 핵산 추출 자동화 분야에서 사용되는 기술 중 하나는 자기 비드 기술을 활용하는 것입니다.
이러한 장비를 사용하면 완전히 자동화된 핵산 추출 프로세스가 가능합니다.
그 결과 정제된 핵산은 PCR 또는 NGS과 같은 다양한 downstream application에 바로 활용할 수 있습니다.
그러나 자동화된 핵산 추출 프로토콜도 여전히 일련의 과정을 진행하기 전에 샘플을 먼저 준비해야 합니다.
보통 10mg 이하의 조직과 샘플 유형에 따라 적당한 시약을 추가합니다.
자동화된 추출 이전의 샘플 준비 단계는 특히 연구자에 의한 오류를 조심해야 합니다.
일관된 조직 용해액을 얻기 위해 Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer를 사용한 재현 가능한 기계적 용해를 제안합니다.
여기에서 OMNI Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer와 핵산추출장비를 함께 사용하여 강력하고 재현 가능한 워크플로우를 통해 소의 간 샘플에서 높은 품질과 양의 DNA를 얻을 수 있음을 보여줍니다.
이 프로토콜은 enzymatic lysis와 비교하여 완전한 샘플 균질화 및 재현성에 중점을 둔 핵산추출 과정이라 할 수 있습니다.
Materials and Methods
• Bead Ruptor Elite (Cat # 19-042E)
• 2 mL Tube Carriage (Cat # 19-373)
• Finger Plate (Cat # 19-370)
• 2 mL Hard Tissue Homogenizing Mix 2.8 mm Ceramic Beads (Cat # 19-628)
 |
|
 |
 |
세라믹 비드 (OMNI, Cat #19-628)가 미리 채워진 32개의 2mL 튜브에 750µL의 조직 용해 완충액을 채웠습니다.
소의 간 약 5g을 -20°C에서 보관한 후 해동했습니다. 그런 다음 이 간을 수동절개를 통해 100g(+/- 1g) 샘플로 분할했습니다.
각 샘플을 미리 준비된 2mL 튜브에 넣고 여기에 18µL의 Proteinase K와 7.5µL의 RNase A를 추가하였습니다.
모든 튜브는 30초 동안 5m/s의 속도로 Bead Ruptor Elite를 사용하여 처리되었습니다.
처리 후, 튜브를 9,000rpm에서 10분 동안 원심분리 했습니다. 원심분리 후 모든 튜브를 37°C에서 30분 동안 인큐베이션 했습니다.
인큐베이션 후 200μL의 각 샘플을 3중으로 2mL plate 에 로딩 했습니다.
그런 다음 이 플레이트를 핵산추출장비에 로장착하고 표준 프로토콜을 실행했습니다.
프로토콜을 완료한 후 플레이트의 각 처리된 샘플에서 생성된 DNA를 Nanodrop을 통해 정량화 했습니다.
추출된 DNA의 총 수율과 A260/A280 비율을 기록하여 샘플의 양과 품질을 평가했습니다.
이 프로세스는 3번에 걸쳐 별도로 수행되었으며 재현성을 평가하기 위해 2-tailed paired t-test를 통해 통계적으로 서로 결과를 비교 하였습니다.
Results
세 번의 시도에서 얻은 핵산 농도는 평균을 내고 NanoDrop에 기록되었으며 농도는 각각 102.86, 101.81 및 100.68ng/µL입니다.
그런 다음 전체 모집단에 걸쳐 표준 편차를 결정하고 각 테스트 날짜의 해당 값에서 RSD(상대 표준 편차) 값을 도출하여 RSD가 각각 10, 14 및 12%가 되었습니다.
각 실행의 평균 값은 two-tailed paired t-test를 사용하여 분석되었습니다.
t-test는 p값이 0.7, 0.4, 0.7인 테스트 1 vs 2, 1 vs 3, and 2 vs 3 간에 유의한 차이를 보이지 않았습니다.
나노드롭으로 측정한 모든 샘플의 평균 A 260/A 280 비율은 1.78인 것으로 나타났습니다.
이것은 일반적인 프로토콜에 따른 고품질 또는 "순수한" DNA의 권장 값입니다.
이와 같은 고품질 DNA는 다운스트림 애플리케이션에서 보다 정확한 결과를 생성하는 데 도움이 됩니다.
Figure 1. Average Nucleic Acid Concentration per Trial as shown in ng/µL. Each trial had the complete concentrations averaged and statistically evaluated as discussed in the methods section.
Figure 2. Distribution of Nucleic Acid Concentrations per Replicate. The green diamonds represent the obtained nucleic acid concentrations in trial 1, the blue squares represent the nucleic acid concentrations in trial 2, and the purple circles represent the nucleic acid concentrations in trial 3. All concentrations were run in triplicate, allowing for addition of the error bars in this figure to show how close the agreeability of the three technical replicates in each trial run.
Conclusion
여기에서 냉동된 소의 간 샘플에서 정제된 DNA를 얻을 때 제안된 추출 워크플로의 3번에 걸친별도의 추출 실험 사이에 유의미한 차이 (p<.05)가 발견되지 않았습니다.
이 데이터를 기반으로 Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer와 Nucleic Acid Extractor의 조합이 downstream genome application을 위한 재현성이 높은 워크플로임을 보여줍니다.
Bead Ruptor Elite와 자동핵산추출장비를 통합하여 훨씬 더 큰 샘플을 고품질 DNA로 처리할 수 있고, 샘플 준비 시간을 절약하고 더 다양한 샘플을 처리할 수 있으며 추출된 핵산의 품질을 보장할 수 있습니다.
Equipment
Bead Ruptor Elite 제품 상세정보 보러가기
•다양하고 견고한 Carriages : 0.5ml screw cap tube ~ 50mL tubes
•독창적인 3D shaking 방식
•터치스크린 인터페이스와 99개의 프로토콜 저장
•안전한 이중 잠금 장치
•편리한 전면 샘플 장착 방식과 온도 센서 내장으로 실험과정 모니터링이 쉬움
•최대 8m/s의 속도로 튜브 모션 최적화
SpinPrep96, Nucleic acid Extractor < 제품 상세 정보 보러가기
• 전, 후 처리 과정이 필요 없는 간편한 실험 과정 (Lysis에서 elution까지 한번에 진행)
• 최대 96개 Sample 추출을 약 20분 이내에 완료 가능
• 오염 방지를 위한 UV Lamp 내장
• Heat block 장착으로 Lysis 및 Elution 시 고수율 및 고순도 보장
• 각 시료에 따른 최적화 된 protocol 제공
Tags
Bovine, Liver, Bead Mill, animal tissue, animal tissue, homogenizer, 호모게나이저, 호모지나이저, 균질기, 파쇄기, 균질화기기, 샘플균질기, 시료균질기, 비드럽터, 핵산추출기, 자동핵산추출장비,자동전처리장비, nucleic acid, DNA, RNA, magnetic beads, PCR, qPCR
전체 0