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Performance Report fluidlab R-300 Cell Counter

세포배양
작성일
2022-05-13 17:50
fluidlab R-300
홀로그램 현미경 및 머신러닝 알고리즘을 이용한 정확하고 재현성 있는 포터블 셀카운터



Introduction

신뢰할 수 있고 정확한 세포 계수는  다앙한 연구분야에서  수행되는 세포 배양이나 생물학 제제 생산 공정 등의 분야에서 매우 중요한 과정입니다.
일반적으로 세포 배양의 성공 여부는 세포 밀도, 형태 및 생존 가능성에 따라 결정됩니다.
현재 수행 가능한 옵션을 고려할 때 많은 사용자가 수동 계수 또는 자동 세포 계수기 사용 중 어떤 세포 계수 방법이 더 나은지 묻곤 합니다.
전통적인 수동 세포 계수는 haemocytometer의 사용법을 포함하며 연구원의 숙련된 세포분석 기술이 필요합니다.
사용자 간 숙련도의 문제 외에도 수동 계수는 자동 계수보다 노동 집약적입니다.

Fluidlab R-300은 최첨단 디지털 홀로그램 현미경과 머신러닝 알고리즘 기반의 완전 자동화된 세포 분석 장비입니다.
명시야 현미경을 기반으로 하는 기존의 자동 세포 계수기와 Fluidlab R-300의 주요 차이점은 홀로그램 기술이 세포에 대한 더 많은 정보를 제공하고 희미한 샘플의 콘트라스트를 향상시키기 위해 추가 염색이 필요하지 않다는 것입니다.
물론 세포 밀도의 정량이나 label-free cell viability 분석 또한 가능합니다.

이 연구에서는 CLSI EP05-A3의 권장 사항에 따라 Fluidlab R-300 셀 카운터의 성능을 평가했습니다.
이를 위해 우리는 뚜렷한 형태와 크기를 가진 세 가지 다른 세포 유형(HeLa, PBMC 및 yeast)을 계수하여 정확도, 정밀도, 선형성 (linearity) 및 반복성을 평가했습니다.
이 데이터는 fluidlab R-300이 넓은 볌위의 세포 유형 및 농도에서 정확하고 믿을만한 결과를 보장한다는 것을 보여줍니다.

Methods

Cell sample preparation
HeLa cells은 DMEM에서 배양되었으며 trypsinization에 의해 플라스크 표면에서 분리되었습니다.
셀 카운터 유효성 검사 시 시료 변동성을 최소화하기 위해 Hela cells를 냉동 배지(DMSO 10%, DMEM cell media 20%)에서 ~10^6 cells/mL의 농도로 작은 aliquot에 동결하고 -20°C에서 저장하였습니다.
마찬가지로 효모세포(Saccharomyces cerevisiae)는 효모배지(NaCl Petone Buffer 및 Saccharose)에서 2일 동안 배양 (20°C)  후 15% 글리세롤(v/v)을 넣어 약 10^7 세포/mL의 농도로 -20°C에서 냉동되었습니다.

모든 테스트에 앞서, HelLa와 효모세포를 빠르게 해동하고, PBS로 세척하고, 원심분리 하였습니다.
상층액을 폐기하고 소량의 HelLa 또는 효모세포 배양매에 세포 펠릿을 다시 모아 HelLa의 경우 ~10^7 cell/mL, 효모세포의 경우 ~10^8 cell/mL의 stock 농도를 산출하였습니다.
세포 농도는 cell stock을 수동으로 세고 배양 배지로 각각의 희석액을 준비하여 제조하였습니다.

검증 실험에 사용된 인간 PBMC 샘플은 샘플에서 적혈구(RBC)를 제거하기 위해 Ficoll-Paque density centrifugation를 통해 건강한 기증자의 buffy coats로부터 추출되었습니다.
Cell pellets은 작은 볼륨의 PBS로 다시 현탁해 약 10^7 cells/mL의 농도를 산출하였습니다.
세포 생존성을 보장하기 위해 샘플은 당일 테스트(격리 후 6시간 이내)까지 4°C에서 보관하였습니다.

Automated cell counting
Fluidlab R-300과 경쟁사 B사의 셀 카운터가 자동 셀 카운팅에 사용되었습니다.
Fluidlab R-300을 사용한 측정을 위해 cell suspension 20 μl를 acella 100 sample carrier에 로드한 다음 Fluidlab R-300에 삽입했습니다.
Fluidlab R-300은 디지털 홀로그램 현미경과 심층 신경망 세포 검출 알고리즘을 기반으로 세포를 카운트하는 장비입니다.
적절한 크기 범위를 설정하면 관심 세포 외에 세포 잔해 등을 분석에서 제외할 수 있습니다.

셀이 카운트 되면 히스토그램에서 크기 범위를 임의로 조정할 수 있습니다. (이는 R-300 만의 장점입니다.)
그런 다음 추가 데이터 분석을 위해 datalab 을 사용하여 PC로 데이터를 내보냈습니다.
비교 연구를 위해, 계수는 또한 제조업체의 지침에 따라 동일한 셀 샘플과 크기 범위를 사용하여 수행되었습니다.

Results
자동화된 세포 계수를 위한 fluidlab R-300의 활용성을 강조하기 위해, 우리는 독특한 형태와 크기를 나타내는 세 가지 다른 세포 유형에서 fluidlab R-300의 성능을 테스트했습니다(그림 1).

HeLa 세포는 생물학 및 임상 연구에서 여전히 널리 사용되는 최초의 불멸의 인간 세포주입니다.
HeLa 세포는 배양 조건에 따라 일반적으로 직경이 20~40µm입니다.
대조적으로, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 직경이 약 7~10μm인 가장 작은 인간 세포 중 하나입니다.

PBMC는 임상 진단 및 면역학의 광범위한 연구 연구에 사용되는 일반적인 1차 세포 공급원입니다.
기존의 세포 계수 방법을 사용하여 1차 세포 샘플의 세포 농도를 정확하게 정량화하는 것은 어려울 수 있습니다.
이는 종종 보이는 이질적 세포 유형과 세포 파편 때문입니다.

마지막으로 평균 크기가 약 5μm인 효모 세포(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하여 매우 작은 세포에서 세포 카운팅 성능을 평가했습니다.
효모는 분자 및 세포 생물학에서 가장 집중적으로 연구된 진핵생물 모델 유기체 중 하나이지만 맥주 양조 및 와인 산업의 발효 과정에도 중요합니다.

Fig1.: Counting of HeLa cells (left), freshly isolated peripheral blood mononuclear cells (PBMCs, middle) and yeast cells (right) with the fluidlab R-300. The holographic microscopy image allows researchers to verify the cell count results based on the green boxes highlighting detected cells. Moreover, cell morphology and the degree of homogeneity of the sample and the presence of debris or dirt in the sample can be evaluated. For better visibility, only a small image section and not the whole field of view (5.3 mm2) is shown here.



The fluidlab R-300 cell counter covers a large concentration rangeFluidlab R-300은 광범위한 농도(10^4~10^7 cell/mL)에서 자동으로 셀을 셀 수 있습니다.
경쟁 세포 계수기와 비교하여 선형성 (linearity)를 평가하기 위해, 세 가지 다른 세포 유형(HelA, PBMC, 효모)의 연속적인 희석 샘플을 지정된 농도 범위에 걸쳐 테스트했습니다.
그림 2는 경쟁 기기와 비교하여 R-300으로 얻은 세 개의 다른 셀 라인에 대한 셀 수를 보여줍니다.
높은 선형성 정도(R2 값)는 R-300 셀 카운터가 넓은 선형 작동 범위에 걸쳐 서로 다른 셀 유형을 안정적으로 감지하고 카운트한다는 것을 보여줍니다.
또한 R-300으로 측정한 전체 총 계수는 경쟁 장치의 총 계수와 비교됩니다 (선형 적합치가 1에 가까운 기울기로 표시됨).

Fig2.: The fluidlab R-300 performs with high linearity across different cell types over a large concentration range. To assess linearity of the fluidlab R-300 in comparison to a competitor cell counter, different concentrations of HeLa cells, PBMCs and yeast were measured in triplicate and on three different days. All measurement results for a given nominal concentration were averaged over all replicates (N=9) and the standard deviation was calculated to assess variability. The same procedure was performed using the competitor cell counter. Error bars denote standard deviations.



Accurate and precise cell counting with the fluidlab R-300
세포 계수기의 정확도는 측정된 값이 '표준' 또는 알려진 값에 얼마나 가까운지를 설명하는 반면 정밀도는 반복 측정값이 서로 얼마나 가까운지를 나타냅니다.
세포 계수의 경우 hemocytometer를 사용한 수동 현미경 계수가 종종 표준 참조 방법으로 간주됩니다.
그러나 수동 계산은 오류가 발생하기 쉽고 시간이 많이 걸리며 사용자의 지식과 숙련도에 크게 의존합니다.

여기에서 우리는 세 가지 다른 세포 유형 및 농도에 대해 수동 계산, fluidlab R-300 및 경쟁사 세포 계수기로 얻은 세포 수를 비교했습니다.
얻은 모든 데이터는 그림 3에 요약되어 있습니다.
Fluidlab R-300 세포 수의 정확도는 10^5~10^7 cells/mL의 농도 범위 내에서 수동 계산과 비슷합니다.
낮은 농도에서 정확도는 수동 계산과 다르지만 경쟁업체 셀 카운터와 비슷합니다.

이것은 보이는 공간에서 더 적은 수의 세포가 감지될 때 부족한 통계와 관련이 있을 수 있습니다.세포 농도가 증가함에 따라 더 많은 수의 세포가 분석에 포함되기 때문에 오류가 감소했습니다.
테스트된 대부분의 세포 유형 및 농도에 대해 fluidlab R-300 세포 수는 매우 정확합니다(그림 3의 작은 오차 막대로 표시됨).
전반적으로, fluidlab R-300은 시료당 30초 이내로 광범위한 세포 유형 및 농도에 걸쳐 정확하고 정확한 세포 계수 결과를 제공합니다.

Fig3.: To determine the accuracy and precision of the fluidlab R-300 cell counter, every sample was counted three times manually in a haemocytometer to determine the standard value and then counted 10 times using the automated cell counter. We performed this test for 3 different cell lines at 3 different concentrations for both the fluidlab R-300 and a competitor cell counter. All measurement results for a given concentration were averaged across all replicates (N=10) and standard deviations were calculated to assess variability. Error bars denote standard deviations.



Automated cell counting ensures reproducible results실험 및 제조 공정에서 재현성을 보장하기 위해 자동화된 세포 계수는 계수마다 약간의 변동성으로 연속적인 반복 실험이 가능해야 합니다.
Fluidlab R-300 세포 계수기의 반복성을 평가하기 위해 10일 동안 3가지 농도에서 3가지 세포 유형(HeLa, PBMC, 효모)을 테스트했습니다.
실험 조건의 잠재적인 변동성을 최소화하기 위해 효모 및 HeLa 세포에 대한 냉동 스톡을 사용하는 반면 PBMC는 매일 혈액에서 신선하게 분리했습니다.

Fig4.: To validate repeatability of the fluidlab R-300 cell counter, multiple samples were measured on 10 days, with two runs per day (morning and afternoon), and two replicates per run. For each cell line (HeLa, PBMCs and yeast), three distinct concentrations were tested. Solid symbols denote averages of replicates on the same day (N=4) for the fluidlab R-300. Error bars show standard deviations. The competitor cell counter results are shown as dotted lines.



HeLa

fluidlab R-300 competitor
nominal concentration [cells/mL] mean [cells/mL] CV mean [cells/mL] CV
5,00E+04 6,64E+04 16% 7,42E+04 24%
5,00E+05 5,39E+05 13% 6,43E+05 17%
5,00E+06 3,76E+06 10% 6,32E+06 15%

PBMCs

fluidlab R-300 competitor
nominal concentration [cells/mL] mean [cells/mL] CV mean [cells/mL] CV
5,00E+04 8,04E+04 21% 5,25E+04 23%
5,00E+05 7,00E+05 14% 4,89E+05 16%
5,00E+06 5,39E+06 11% 4,55E+06 9%

Yeast

fluidlab R-300 competitor
nominal concentration [cells/mL] mean [cells/mL] CV mean [cells/mL] CV
5,00E+04 5,45E+04 31% 4,20E+04 32%
5,00E+05 4,79E+05 26% 3,76E+05 29%
5,00E+06 4,07E+06 17% 2,79E+06 19%



Table1: Summary of the inter-assay variability for three different cell types at three different nominal concentrations across 10 different days (with duplicate measurements in the morning and afternoon, N=40). Automated cell counting of each sample was performed both with the fluidlab R-300 and the competitor cell counter. The comparably lower coefficient of variation (CV) of the fluidlab R-300 shows that cell count results are very reproducible across all tested cell types and concentrations.


Summary

여기에서 우리는 Fluidlab R-300이 PBMC 및 효모 세포와 같은 이종 샘플 및 소규모 세포를 포함하여 다양한 세포 유형에 걸쳐 자동화된 세포 계수에 성공적으로 사용될 수 있음을 보여주었습니다.
이렇게 정확한 결과와 높은 재현성을 보여주는 fluidlab R-300은 cell proliferation monitoring, cell culture maintenance, bioprocessing과 같은 다양한 어플리케이션에서 활용될 수 있습니다.

Equipment

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Cell Counter
•세포 생존력 측정
•넓은 FoV

Spectrometer
•소량의 시료만으로도 충분 (4-20 µl)
•스펙트럼 그래프 저장 (375 ~ 700 nm)
•사용시 보정 불필요
•휴대 가능한 작은 크기

Areas of application:

+Microscopic analysis of particles in fluids
+Spectrophotometric analysis of fluids with high optical densities

Examples of applications:

+General cell counting and basic classification (yeast, HeLa, algea, stem cells, leukocytes)
+General particle counting and basic classification
+Haemoglobin in whole blood
+Haematocrit in whole blood
+Fluid condition monitoring, fluid cleanliness management

Tags
셀카운팅, 세포생존력, 흡광도, 산란광, 세포계수기, cell counting, cell viability, optical density, OD, Digital Holography, 표준곡선 standard curve, HeLa cells.
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