Detection of SARS-CoV-2 from Wastewater Samples Utilizing the Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer
Authors: Caleb M Proctor, M.S.; Gabriella L Ryan, M.S.; Zachary P Morehouse, D.O., M.S.; Rodney J Nash, Ph.D.
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Description

SARS-CoV-2는 분변 배출 이나 에어로졸화된 호흡 분비를 통해 확산되는 것으로 입증된 COVID-19 관련 질환을 유발하는 것으로 알려져 있습니다.
지역사회의 폐수를 정기적으로 샘플링함으로써, 관련 공무원이나 연구원들은 SARS-CoV-2 RNA의 초기 확산 상태를 파악할 수 있습니다.

현재, 대부분의 폐수 감시 프로그램은 알려진 SARS-CoV-2 유전자 표적을 감지하기 위해,
하수 처리 시설이나 폐수 처리 공장 등에서 물 샘플을 획득하여 체계적으로 핵산 추출 및 RT-PCR amplification을 진행하여 이루어 지고 있습니다.

여기서, 우리는 OMNI Bead ruptor elite를 이용하여 filter homogenization를 위한 간소화된 방법에 대해 살펴보고,
자동 핵산추출장비와 전용추출시약을 이용하여 SARS-CoV-2 RNA 추출을 진행해 보았습니다.

Materials and Methods

• Bead Ruptor Elite (Cat # 19-042E)
• 2 mL Tube Carriage (Cat # 19-373)
• 48 position 2 mL Tube Carriage & Finger Plate (Cat # 19-378)
• Finger Plate (Cat # 19-370)
• 2mL Hard Tissue Homogenizing Mix (Cat # 19-628)

Sample Acquisition
휴스턴 시(미국 텍사스주 휴스턴) 보건부로부터 이 검증 연구에 사용할 알려진 SARS-CoV-2 양성 폐수 샘플을 제공 받았습니다.

Filter Processing on the Bead Ruptor Elite Bead Mill Homogenizer
SARS-CoV-2 양성 폐수에 니트로셀룰로오스 필터를 추출시약에 포함된 600μL의 Lysis Buffer와 함께 각각의 2 mL Hard Tissue Homogenization Mix Tubes (OMNI, #19-628)에 넣었습니다.
그런 다음 샘플을 48 Position 2mL Tube Carriage (OMNI, # 19-378)를 사용하여 Bead Ruptor Elite (OMNI, #19-042E)에 놓고 60초 동안 6.0m/s에서 균질화 하였습니다.
샘플을 12,500rpm에서 4분 동안 원심분리하여 RNA 추출을 위해 자동핵산추출장비로 옮겼습니다.

Automated RNA Extraction
정확히 300μL의 homogenate을 96well plate에 로딩하고 자동핵산추출장비에서 제조업체(PerkinElmer)의 지침에 따라 추출작업을 진행했습니다.

Viral Detection and Quantification
용출된 RNA 5ul 을 SARS-CoV-2 RNA 검출을 위해 RT-PCR을 수행하였습니다.
SARS-CoV-2 RNA의 RT-PCR 검출 및 정량을 위해 SARS-CoV-2 RT-PCR test (IDEXX, #99-57004)를 사용하였습니다.
RT-PCR은 제조사의 지침에 따라 오차없이 진행되었습니다.

Results
필터에서 SARS-CoV-2의 폐수 검출을 위해 제안된 방법을 활용하여 알려진 양성 샘플의 100%에서 SARS-CoV-2 RNA를 성공적으로 증폭할 수 있었고,
바이러스의 가장 낮은 검출 농도는 6.4 viral copies/μL 이었습니다. (첨부파일, Table1).

RT-PCR 데이터는 다양한 바이러스 농도의 폐수 필터에서 SARS-CoV-2 검출에 대해 제안된 실험 과정의 재현성을 보여줍니다.
이 방법을 사용할 때 모든 농도에서 관찰된 평균 Ct는 30.30이었고 표준 편차는 1.23으로 미국 질병통제예방센터(CDC) 및 세계보건기구(WHO) 권장 사항 (Ct 40) 보다 훨씬 낮습니다.

References

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