The cDNA yield is low. What can I do to help?

우선 downstream PCR/qPCR 수율 보다 cDNA 수율이 낮거나 Ct 값이 만족스럽지 않은지 확인하는 것이 좋습니다.

전자의 경우, UltraScript 2.0을 사용할 때 낮은 수율이 발생하는 여러 가지 이유가 있을 수 있습니다.

1. RNA의 양이 적거나 제대로 추출되지 않은 경우 PCR/qPCR에 필요한 양이 나오지 않을 수 있습니다.
   RNA에 대한 다른 정제 프로토콜을 검토 하거나 초기에 RNase inhibitor를 사용해 보십시오.
   PCRBIO의 모든 제품은 RNase inhibitor를 포함하고 있지만, 일부 애플리케이션의 경우 RT 단계 전에 추가해야 할 수도 있습니다.
2. RNA prep에는 haem, 고농도의 NaCl, SDS, guanidine thiocyanate, 멜라닌 또는 칼슘과 같은 억제제가 포함될 수 있습니다.
   반응을 억제할 수 있는 모든 물질을 제거하는 다른 정제 방법을 시도해 보십시오.
   반응 전에 RNA를 희석해 볼 수도 있습니다.
   이 과정은 이론적으로는 수율을 감소시키지만, RTase의 효율적인 작용을 위해 억제제도 희석시켜 줄 것입니다.
3. 일부 RNA는 RTase의 이상적인 substrate가 아닌 2차 구조나 배열 때문에 본질적으로 전사하기 어려울 수 있습니다.
   RTase를 첨가하기 전에 온도를 높여보거나 RNA denaturation/primer annealing을 70°C에서 10분 동안 수행해 보십시오.
4. RT 단계 후에 RNAseH를 처리하면 RNA-DNA heteroduplexes가 만들어지고 이는 DNA-DNA duplexes 보다 더 안정적이기 때문에 GC-rich target의 경우 수율을 증가시킬 수 있습니다.
5. 위를 모두 검토해 보아도 여전히 반응이 제대로 진행되지 않을 경우에는 프라이머나 oligo(dT)에 대해 좀 더 특이적인 접근 방식을 사용해야 할 수 있습니다.
   이를 위해 hexamer및 oligo(dT)가 없는 버퍼와 함께 제공되는 UltraScript 2.0 Reverse Transcriptase를 권장합니다.

Ct 값이 만족스럽지 않을 경우에는 겔 전기영동을 수행하여 cDNA 제품의 양을 확인합니다.

RT 단계 이후 cDNA 생성물의 양이 충분하지 않으면 RTase가 Taq의 활성을 저해하는 문제가 있을 수 있습니다.
cDNA 생성물을 10~20배 희석하여 해결한 후, 이 희석된 반응의 2.5μL를 총 반응 볼륨 20 μL에 첨가합니다. (볼륨이 다른 경우 적절히 조정).
또는 5x, 10x, 20x 및 40x 희석법을 수행하여 RT 단계 전에 효소 자체를 희석해 보십시오.
최적의 결과를 찾기 위해 추가 조정이 필요한 경우 이 두 절차를 결합하여 진행할 수도 있습니다.

Related Reagents

PCRbiosystems, UltraScript 2.0 Reverse Transcriptase & Kits


• 55°C~65°C 이상 온도에서 작동하는 고내열성
• 향상된 RNase inhibitor 포함
• 최소 20pg 의 total RNA에서도 높은 cDNA 수율 확보
• GC-rich template에서도 정확한 역전사 반응
• low copy number transcripts 도 민감하게 감지
• RNase H 활성 감소
• Mg및 dNTP를 포함한 advanced buffer 제공

제품상세정보 바로가기 : UltraScript 2.0 Reverse Transcriptase & Kits