Application
NGS library의 정량 by Clarity digital system
Digital PCR
작성일
2022-04-12 13:56
Accurate quantification of Illumina® NGS libraries using Clarity digital PCR system
I. Overview
차세대 시퀀싱(NGS)의 등장으로 전례 없는 해상도와 정확성으로 genome scale 시퀀스 데이터를 신속하고 효율적으로 생성할 수 있게 되었습니다.
Illumina® 시퀀싱 플랫폼의 경우 DNA 라이브러리가 증폭되어 flow cell에서 시퀀싱 하기 전에 클러스터를 생성합니다.
고품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 flow cell에 적절한 양의 라이브러리 DNA를 로드하여 최적의 밀도로 클러스터를 생성하여야 합니다.
DNA의 양이 불충분하면 클러스터 밀도가 낮아져 시퀀싱 수율이 감소하게 되고, 반면에 너무 많으면 데이터 품질이 저하될 수 있습니다.
따라서 flow cell을 로드하기 전에 라이브러리를 정확하게 정량 하는 것이 Illumina® NGS 실험 과정의 핵심이라고 할 수 있습니다.
NGS 라이브러리를 정량하는 표준 방법 (예: 분광 광도 및 형광 분석)은 총 DNA 함량을 알려줄 뿐 adapter-bound library fragment에 대해서는 특이하지 않아 정확한 정량이 어렵습니다.
quantitative PCR은 adapter-ligated sequences만 감지하여 더 정확한 대안을 제공하지만, 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸릴 수 있는 표준 곡선을 생성해야 하는 번거로움이 있습니다.
반면 digital PCR은 표준 곡선이 필요 없이 빠르고 정확한 라이브러리 정량이 가능합니다.
여기서는 Clarity digital PCR system을 사용하여 NGS 시퀀싱 라이브러리를 정확하게 정량 할 수 있음을 보여줍니다.
II. Clarity plus PCR system accurately quantifies DNA fragments flanked by the Illumina® P5 and P7 sequences
Illumina® NGS 라이브러리를 정량 할 때 Clarity digital PCR system의 정확성과 정밀도는 P5 및 P7 flow cell 옆에 있는 DNA standards를 사용하여 검증되었습니다.
서열 정보는 Table 1 and Figure 2에 있으며, EvaGreen® 기반 분석을 사용하면 라이브러리 준비 방법에 관계없이 Illumina® NGS 라이브러리의 정확한 정량을 위한 비용 효율적이고 다양한 플랫폼을 제공합니다.
III. Conclusion
Clarity digital PCR system은 Illumina® NGS 라이브러리의 정확한 정량을 지원하므로 최적의 클러스터 밀도를 찾아 고품질 시퀀싱 데이터를 생성할 수 있습니다.
IV.References
[1] Illumina (2015) An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology.
[2] Huggett JF, Cowen S and Foy CA. (2015) Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 61, 79-88.
[3] Baker M. (2012) Digital PCR hits its stride. Nature Methods 9, 541–544.
[4] KAPA Biosystems (2014) KAPA Library Quantification Technical Guide (KAPA Library Quantification Kits for Illumina® platforms)
Equipment
Clarity Plus Digital PCR system 상세보기
• 절대 정량
• 샘플 손실 최소화
• 정확성 향상
• 빠른 처리 시간
• 연구자만의 분석 방법 설계 가능
Application
• Cell-free nucleic acid analysis
• Quantification of reference materials
• Copy number variant analysis
• Bacterial / Viral load quantification
• Next-generation sequencing (NGS) applications
• Minimum Sample Loss
• Fast Turnaround Time
• Ability to design your own assay
• SNP quantification
• Rare variant detections
• Genomic alterations
• Gene expression analysis
• Digital PCR assay customization
Tags
#digital_PCR, #dPCR, #qPCR, #유전자, #유전자증폭, #clarity, #real-time PCR, #CNV , #DGE , #mutation #돌연변이 #대립유전자
I. Overview
차세대 시퀀싱(NGS)의 등장으로 전례 없는 해상도와 정확성으로 genome scale 시퀀스 데이터를 신속하고 효율적으로 생성할 수 있게 되었습니다.
Illumina® 시퀀싱 플랫폼의 경우 DNA 라이브러리가 증폭되어 flow cell에서 시퀀싱 하기 전에 클러스터를 생성합니다.
고품질 시퀀스 데이터를 얻으려면 flow cell에 적절한 양의 라이브러리 DNA를 로드하여 최적의 밀도로 클러스터를 생성하여야 합니다.
DNA의 양이 불충분하면 클러스터 밀도가 낮아져 시퀀싱 수율이 감소하게 되고, 반면에 너무 많으면 데이터 품질이 저하될 수 있습니다.
따라서 flow cell을 로드하기 전에 라이브러리를 정확하게 정량 하는 것이 Illumina® NGS 실험 과정의 핵심이라고 할 수 있습니다.
NGS 라이브러리를 정량하는 표준 방법 (예: 분광 광도 및 형광 분석)은 총 DNA 함량을 알려줄 뿐 adapter-bound library fragment에 대해서는 특이하지 않아 정확한 정량이 어렵습니다.
quantitative PCR은 adapter-ligated sequences만 감지하여 더 정확한 대안을 제공하지만, 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸릴 수 있는 표준 곡선을 생성해야 하는 번거로움이 있습니다.
반면 digital PCR은 표준 곡선이 필요 없이 빠르고 정확한 라이브러리 정량이 가능합니다.
여기서는 Clarity digital PCR system을 사용하여 NGS 시퀀싱 라이브러리를 정확하게 정량 할 수 있음을 보여줍니다.
Figure 1. Illumina® NGS library quantification workflow using Clarity digital PCR system.
II. Clarity plus PCR system accurately quantifies DNA fragments flanked by the Illumina® P5 and P7 sequences
Illumina® NGS 라이브러리를 정량 할 때 Clarity digital PCR system의 정확성과 정밀도는 P5 및 P7 flow cell 옆에 있는 DNA standards를 사용하여 검증되었습니다.
서열 정보는 Table 1 and Figure 2에 있으며, EvaGreen® 기반 분석을 사용하면 라이브러리 준비 방법에 관계없이 Illumina® NGS 라이브러리의 정확한 정량을 위한 비용 효율적이고 다양한 플랫폼을 제공합니다.
| DNA Standard | Expected concentration (copies/µL) |
Measured Concentration (copies /µL) |
Relative Uncertainty (%) |
| 4 | 1205 | 1547 | 2.80 |
| 4/2* | 603 | 790 | 1.39 |
| 5 | 121 | 148 | 2.37 |
| 5/2* | 60 | 74 | 3.99 |
| 6 | 12 | 15 | 2.38 |
| 6/2* | 6 | 8 | 4.94 |
| Table 1. Quantification of the Illumina® NGS standards using Clarity digital PCR system. The EvaGreen® dye-based digital PCR assay was designed to amplify the 452bp library fragment using primers that target the P5 (5’AATGATACGGCGACCACCGA-3’) and P7 (5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’) sequences. Analyses were performed on Standards 4, 5, 6, and their respective two-fold dilutions (marked with an asterisk), whose expected copies per microliter of reaction fall within the dynamic range of the system. The results shown are representative of three independent experiments performed in triplicates. | |||
Figure 2. Graphical representation of the results obtained in Table 1. Error bars denote standard deviations of each set of triplicates
III. Conclusion
Clarity digital PCR system은 Illumina® NGS 라이브러리의 정확한 정량을 지원하므로 최적의 클러스터 밀도를 찾아 고품질 시퀀싱 데이터를 생성할 수 있습니다.
IV.References
[1] Illumina (2015) An Introduction to Next-Generation Sequencing Technology.
[2] Huggett JF, Cowen S and Foy CA. (2015) Considerations for digital PCR as an accurate molecular diagnostic tool. Clin Chem. 61, 79-88.
[3] Baker M. (2012) Digital PCR hits its stride. Nature Methods 9, 541–544.
[4] KAPA Biosystems (2014) KAPA Library Quantification Technical Guide (KAPA Library Quantification Kits for Illumina® platforms)
Equipment
Clarity Plus Digital PCR system 상세보기
• 절대 정량
• 샘플 손실 최소화
• 정확성 향상
• 빠른 처리 시간
• 연구자만의 분석 방법 설계 가능
Application
• Cell-free nucleic acid analysis
• Quantification of reference materials
• Copy number variant analysis
• Bacterial / Viral load quantification
• Next-generation sequencing (NGS) applications
• Minimum Sample Loss
• Fast Turnaround Time
• Ability to design your own assay
• SNP quantification
• Rare variant detections
• Genomic alterations
• Gene expression analysis
• Digital PCR assay customization
Tags
#digital_PCR, #dPCR, #qPCR, #유전자, #유전자증폭, #clarity, #real-time PCR, #CNV , #DGE , #mutation #돌연변이 #대립유전자
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