Application
Optimize your cDNA synthesis in 5 steps
qPCR assay
작성일
2022-03-15 15:20
Tips and tricks for cDNA synthesis
Optimize your cDNA synthesis in 5 steps
좋은 품질의 cDNA는 신뢰할 수 있는 qPCR 실험의 핵심입니다.
명쾌하고 재현 가능한 결과를 내기 위해 도움이 되는 일련의 팁을 안내해 드립니다.
1. Template preparation
좋은 품질의 template RNA를 준비합니다.
- 고순도 A260/A280 > 1.8 및 A260/A230 > 2.0,
- 선호하는 방법: column purification, Trizol, magnetic beads
poly-A 농축이 필요한 경우 적절한 magnetic bead purification를 이용하는 것이 좋습니다.
선택적으로, agarose gel 전기영동을 사용하여 RNA가 분해되지 않도록 할 수 있습니다.
그러나 이것은 대부분의 cDNA applications에 대한 표준 요구 사항이 아닙니다.
2. Eliminate genomic DNA
DNase I에 의한 DNase digestion으로 오염된 genomic DNA를 제거합니다.
샘플에 흔적이 남아 있는 경우 다운스트림 단계에서 cDNA를 분해하므로 DNase가 비활성화되거나 샘플에서 제거되었는지 확인합니다.
이 처리는 항상 컬럼 정제를 통해 잘 준비된 RNA에서 수행되어야 합니다.
보통 Trizol 및 이와 유사한 시약은 RNA preparation에서 DNA를 완전히 제거할 수 있습니다.
그러나 DNA 오염이 우려되는 경우 연속적으로 DNase를 처리할 수 있습니다.
위의 모든 단계를 수행했지만 여전히 샘플의 DNA 오염이 의심되는 경우 genomic DNA target에 대해 PCR 또는 qPCR을 실행하여 전체 gDNA를 제거 하십시오.
양성 gDNA 샘플을 대조군으로 사용하여 RNA 샘플에 검출 가능한 수준의 gDNA 오염이 없는지 확인해야 합니다.
3. Choose the right reverse transcriptase
생성된 cDNA에 대해 진행하고자 하는 application에 따라 특정 특성을 가진 효소가 필요할 수 있습니다.
예를 들어, library 구성을 위한 tagging 및 미지의 서열에 대한 클로닝(5'RACE)는 MMLV RTase와 같은 두 번째 가닥 합성을 위한 terminal transferase 활성이나 template switching 기능을 가진 RTase가 필요합니다.
또한, qPCR을 위한 cDNA를 준비할 때 더 짧은 transcripts가 필요한 경우에는 AMV RTase가 적절할 수 있습니다.
최적의 반응 온도, 사용된 RNA 템플릿의 복잡성(2차 구조 형성) 또는 미량의 템플릿에 대한 민감도 등을 기반으로 applications에 맞는 적절한 RTase를 찾으십시오.
RTase mix에 RNase inhibitor가 포함되어 있지 않은 경우 reaction mix에 inhibitor를 추가하여 RNA무결성이 보호되도록 해야 합니다.
4. Pick the best priming strategy
qPCR을 통한 multiple transcript target의 정량화 또는 DNA library 구성에 cDNA를 사용하려는 경우 모든 전사체에 대해 양질의 첫 번째 가닥 cDNA를 얻는 것이 무엇보다 중요합니다.
따라서 random hexamers 와 oligo-dT primers를 사용하는 혼합 프라이밍 접근법이 권장됩니다.
(예를 들어, 박테리아 전사체는 polyadenylated 되지 않기 때문에 prokaryotic RNA에 oligo-dT를 사용하는 것은 무의미합니다.).
특정 전사체만 복제하거나 정량화 하려면 representation보다 full-length transcript를 확보하는 것이 중요합니다.
목표 전사체가 완전히 역전사되도록 하기 위해 oligo-dT 또는 gene-specific primers (GSP)를 선택합니다.
드물게 cDNA의 3' 농축이 필요한 경우, eukaryotic and archaeal transcript에 oligo-dT primers를 사용합니다.
5. Optimize reaction conditions
첫 번째 가닥 합성이 시작되기 전에 template RNA가 완전히 변성되었는지 확인하십시오.
이는 대상에 어려운 템플릿(GC가 풍부한, 헤어핀 또는 기타 2차 구조)이 포함될 경우 중요합니다.
full template denaturation을 위해서 라면 70°C에서 5분 동안 reaction buffer에서 RNA와 프라이머를 반응시킨 다음 RTase를 추가하기 전에 얼음 등을 사용하여 빠르게 냉각시켜 줘야 합니다.
최적의 반응 시간을 찾아내기 위해서는 제조업체가 권장하는 시간 이상으로 반응시간을 늘려야 할 수도 있습니다.
6. Optional: Check the quality of your cDNA
Downstream application에 대한 cDNA 품질을 확인합니다.
qPCR을 실행하는 경우 normalizing 절차를 거처 모든 검체에서 기준 유전자의 Cq 값을 설정합니다.
이 값을 이전 cDNA batch와 비교하고 필요한 경우 모든 검체에 비슷한 농도의 cDNA가 포함되도록 검체를 적절히 희석할 수 있습니다.
이 접근 방식은 qPCR 대상이 <0.2kb로 유지되기 때문에 긴 전사체의 성공적인 역전사를 확인하는 데 적합하지 않을 수 있습니다.
따라서 0.5kb를 초과하는 긴 전사체의 존재를 확인해야 하는 경우 두 번째 가닥 DNA 합성 (일반적으로 적절한 프라이머를 사용한 표준 PCR)을 실행하고 cDNA 샘플 일부를 아가로스 겔에서 확인합니다.
full length transcripts의 전사를 확인려면 약 500bp에서 3-4kb 범위의 smear band가 관찰인 되어야 합니다.
7. Proceed with your downstream application.
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UltraScript 2.0 Reverse Transcriptase & Kits > 제품정보 상세 보기
• 55 ° C ~ 65 ° C 이상온도에서 작동하는 고 내열성 역전사 효소
• Advanced RNase inhibitor
• 최소 20pg 의 total RNA에서도 높은 cDNA 수율 확보
• GC가 풍부하고 고도로 구조화 된 template 에서도 정확한 역전사
• Sensitive detection of low copy number transcripts
• Reduced RNase H activity
• Mg 및 dNTP를 포함한 advanced buffer
Tag
cDNA, RNA, RTase, dNTP, complementary DNA, reverse transcriptase, real-time PCR, qPCR, oligo dT, primer, probe random hexamer, MMLV, dNTPs, RNase inhibitor
Optimize your cDNA synthesis in 5 steps
좋은 품질의 cDNA는 신뢰할 수 있는 qPCR 실험의 핵심입니다.
명쾌하고 재현 가능한 결과를 내기 위해 도움이 되는 일련의 팁을 안내해 드립니다.
1. Template preparation
좋은 품질의 template RNA를 준비합니다.
- 고순도 A260/A280 > 1.8 및 A260/A230 > 2.0,
- 선호하는 방법: column purification, Trizol, magnetic beads
poly-A 농축이 필요한 경우 적절한 magnetic bead purification를 이용하는 것이 좋습니다.
선택적으로, agarose gel 전기영동을 사용하여 RNA가 분해되지 않도록 할 수 있습니다.
그러나 이것은 대부분의 cDNA applications에 대한 표준 요구 사항이 아닙니다.
2. Eliminate genomic DNA
DNase I에 의한 DNase digestion으로 오염된 genomic DNA를 제거합니다.
샘플에 흔적이 남아 있는 경우 다운스트림 단계에서 cDNA를 분해하므로 DNase가 비활성화되거나 샘플에서 제거되었는지 확인합니다.
이 처리는 항상 컬럼 정제를 통해 잘 준비된 RNA에서 수행되어야 합니다.
보통 Trizol 및 이와 유사한 시약은 RNA preparation에서 DNA를 완전히 제거할 수 있습니다.
그러나 DNA 오염이 우려되는 경우 연속적으로 DNase를 처리할 수 있습니다.
위의 모든 단계를 수행했지만 여전히 샘플의 DNA 오염이 의심되는 경우 genomic DNA target에 대해 PCR 또는 qPCR을 실행하여 전체 gDNA를 제거 하십시오.
양성 gDNA 샘플을 대조군으로 사용하여 RNA 샘플에 검출 가능한 수준의 gDNA 오염이 없는지 확인해야 합니다.
3. Choose the right reverse transcriptase
생성된 cDNA에 대해 진행하고자 하는 application에 따라 특정 특성을 가진 효소가 필요할 수 있습니다.
예를 들어, library 구성을 위한 tagging 및 미지의 서열에 대한 클로닝(5'RACE)는 MMLV RTase와 같은 두 번째 가닥 합성을 위한 terminal transferase 활성이나 template switching 기능을 가진 RTase가 필요합니다.
또한, qPCR을 위한 cDNA를 준비할 때 더 짧은 transcripts가 필요한 경우에는 AMV RTase가 적절할 수 있습니다.
최적의 반응 온도, 사용된 RNA 템플릿의 복잡성(2차 구조 형성) 또는 미량의 템플릿에 대한 민감도 등을 기반으로 applications에 맞는 적절한 RTase를 찾으십시오.
RTase mix에 RNase inhibitor가 포함되어 있지 않은 경우 reaction mix에 inhibitor를 추가하여 RNA무결성이 보호되도록 해야 합니다.
4. Pick the best priming strategy
qPCR을 통한 multiple transcript target의 정량화 또는 DNA library 구성에 cDNA를 사용하려는 경우 모든 전사체에 대해 양질의 첫 번째 가닥 cDNA를 얻는 것이 무엇보다 중요합니다.
따라서 random hexamers 와 oligo-dT primers를 사용하는 혼합 프라이밍 접근법이 권장됩니다.
(예를 들어, 박테리아 전사체는 polyadenylated 되지 않기 때문에 prokaryotic RNA에 oligo-dT를 사용하는 것은 무의미합니다.).
특정 전사체만 복제하거나 정량화 하려면 representation보다 full-length transcript를 확보하는 것이 중요합니다.
목표 전사체가 완전히 역전사되도록 하기 위해 oligo-dT 또는 gene-specific primers (GSP)를 선택합니다.
드물게 cDNA의 3' 농축이 필요한 경우, eukaryotic and archaeal transcript에 oligo-dT primers를 사용합니다.
5. Optimize reaction conditions
첫 번째 가닥 합성이 시작되기 전에 template RNA가 완전히 변성되었는지 확인하십시오.
이는 대상에 어려운 템플릿(GC가 풍부한, 헤어핀 또는 기타 2차 구조)이 포함될 경우 중요합니다.
full template denaturation을 위해서 라면 70°C에서 5분 동안 reaction buffer에서 RNA와 프라이머를 반응시킨 다음 RTase를 추가하기 전에 얼음 등을 사용하여 빠르게 냉각시켜 줘야 합니다.
최적의 반응 시간을 찾아내기 위해서는 제조업체가 권장하는 시간 이상으로 반응시간을 늘려야 할 수도 있습니다.
6. Optional: Check the quality of your cDNA
Downstream application에 대한 cDNA 품질을 확인합니다.
qPCR을 실행하는 경우 normalizing 절차를 거처 모든 검체에서 기준 유전자의 Cq 값을 설정합니다.
이 값을 이전 cDNA batch와 비교하고 필요한 경우 모든 검체에 비슷한 농도의 cDNA가 포함되도록 검체를 적절히 희석할 수 있습니다.
이 접근 방식은 qPCR 대상이 <0.2kb로 유지되기 때문에 긴 전사체의 성공적인 역전사를 확인하는 데 적합하지 않을 수 있습니다.
따라서 0.5kb를 초과하는 긴 전사체의 존재를 확인해야 하는 경우 두 번째 가닥 DNA 합성 (일반적으로 적절한 프라이머를 사용한 표준 PCR)을 실행하고 cDNA 샘플 일부를 아가로스 겔에서 확인합니다.
full length transcripts의 전사를 확인려면 약 500bp에서 3-4kb 범위의 smear band가 관찰인 되어야 합니다.
7. Proceed with your downstream application.
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• 55 ° C ~ 65 ° C 이상온도에서 작동하는 고 내열성 역전사 효소
• Advanced RNase inhibitor
• 최소 20pg 의 total RNA에서도 높은 cDNA 수율 확보
• GC가 풍부하고 고도로 구조화 된 template 에서도 정확한 역전사
• Sensitive detection of low copy number transcripts
• Reduced RNase H activity
• Mg 및 dNTP를 포함한 advanced buffer
Tag
cDNA, RNA, RTase, dNTP, complementary DNA, reverse transcriptase, real-time PCR, qPCR, oligo dT, primer, probe random hexamer, MMLV, dNTPs, RNase inhibitor
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