Application

Total Protein Normalization

단백질 분석
작성일
2022-02-22 14:02
Total Protein Normalization by Stain-Free technology and Uvitec Q9 imagers

01. Introduction

현재 단백질 분석에 널리 사용되는 Western blotting을 이용하여 단백질의 발현량의 비교를 위해서는 표적 단백질 양을 정량하는 과정이 필요합니다.
웨스턴 후 나타나는 샘플과 Lane간의 불균형을 최소화하기 위해서는 기준을 잡고 보정 (normalize)하는 과정을 거쳐야 합니다.
이는 나중에 샘플 단백질 로딩의 지표로 사용됩니다.
여기서는 몇가지 Normalization 방법 중 Housekeeping protein(HKP)을 이용한 data normalization 방법을 소개합니다

하우스키핑 단백질은 생체 내에서 안정적으로 발현되어 Western blot normalization를 위한 로딩 컨트롤로 많이 사용되지만, 일부 실험 조건에서는 이 단백질을 안정적으로 검출하기 어렵습니다.
이러한 경우 Stain-free gel을 사용하여 정량화된 각 샘플의 총 단백질 수준에 대해 보정을 진행할 수 있습니다.

02. Experimental Conditions

배양된 성상교세포에서 glutamate transporter GLT-1의 발현에 대한 beta-lactam 항생제의 효과를 알아보기 위해, 세포(120,000 cells/well for 12-well plates)를 48시간 동안 항생제의 용량을 증가시키면서 DIV20에서 처리하였습니다.
배양액 (DMEM-HAM F10, 10%FBS, 1% Pen/Strep)에 물에 녹인 항생제를 첨가하였습니다.

성상세포를 Laemmli 완충액(50 μl/well for 12-well plates)을 사용하여 용해시키고 95°C에서 3분 동안 끓였습니다.
15μg의 단백질에 해당하는 15μl의 protein lysates를 4-15% Stain-free gel에 로딩하고 200V에서 전기영동 했습니다.
그 후 젤을 UV transilluminator (HD6, UVITEC)에 직접 놓고 60초 동안 활성화했습니다 (그림 1). 그런 다음, Transfer 장비를 사용하여 NC membrane에 blotting하였습니다.

멤브레인을 blocking solution (Tris-buffered saline containing 0.1% Tween-20 [TBS-T] and 5% non-fat dry milk))에서 1시간 동안 블로킹한 다음 antiGLT1 primary antibody(Santa Cruz)와 함께 밤새(4°C) 인큐베이션 했습니다.
TBS-T에서 3회 세척한 후, 블롯을 anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody (1:10000 in 5% milk in TBS-T)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고 ECL substrate를 처리한 다음 Alliance Q9 system (UVITEC, UK)을 사용하여 밴드 이미지를 얻었습니다.
UVITEC 소프트웨어를 사용하여 GLT-1 밴드의 부피를 측정하고 해당 stain lane으로 값을 보정했습니다.
모든 측정에 대해 아무것도 처리하지 않은 대조군의 평균값을 100%로 설정하여 기준을 잡고 측정 데이터는 이에 대한 백분율로 표시하였습니다.

Protein Normalization 과정

1. 각 lane에 일정량의 Housekeeping protein을 로딩하여 전기영동 합니다.
2. 첫 HKP band intensity를 1로 잡았을 때 각 밴드 intensity 비율(Ref. ratio)을 구합니다.
3. 표적 단백질의 웨스턴 블랏을 진행한 다음 보정(normalization) 합니다.
*보정값 = 각 lane의 표적 단백질 밴드 intensity값 / 각 lane의 Ref. ratio

03. Conclusion

선택된 beta-lactam 항생제는 배양된 성상세포에서 용량이 늘어남에 따라 GLT-1의 발현을 증가시키는 양상을 보입니다. (그림 2).

Figure1. Image of Stain-Free Gel After UV Activation. Samples are indicated upon each band. C=control, 10=10µM, 100=100µM, 500=500µM of the beta-lactam antibiotic. After electrophoretic separation, the gel was directly placed on the UV-transilluminator (HD6, UVITEC Ltd, UK) and activated for 60 seconds Figure2. Chemiluminescence Signal Of GLT-1 After ECL Reaction. Samples are indicated upon each band. C=control, 10=10µM, 100=100µM, 500=500µM of the beta-lactam antibiotic. The selected beta-lactam antibiotic increases the expression of GLT-1 in cultured astrocytes in a dose-dependent manner.

출처: Frasca A., Albizzati E., Dept. of Medical Biotechnology and Translational Medicine, L.I.T.A., University of Milan, Italy

Equipment Link:

XinPRO Vertical Electrophoresis Tank
• eBlot L1 Protein Transfer System
eZwest Automated Western blot Device
UVIdoc HD6 Gel Imaging System
Alliance Q9 Chemiluminescence Imaging System/
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