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FAQ for qPCRBIO Probe Mixes, PCRbiosystems

qPCR assay
작성일
2021-11-19 15:58
FAQ for qPCRBIO Probe Mixes

qPCRBIO Probe Mixes는 어떻게 구성되어 있나요?
바로 사용 가능한 qPCR 2x master mix 가 들어 있으며, primer, template DNA 및 PCR grade DW만 추가하려 반응을 진행하면 됩니다.

표준 희석으로 진행시 증폭 효율이 감소하는 경우 해결 방법은 무엇입니까?

표준곡선에 대한 후속 희석으로 효율성이 감소할 수 있다고 보고되었습니다.
Standards를 10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA, 0.05% Tween-20으로 희석하여 이를 피하는 것이 좋습니다.
EDTA는 chelating agent 로써 DNAse 활성을 방지하는 역할을 합니다.
Tween-20은 detergent 이며 DNA가 튜브 측면에 흡착되는 것을 방지합니다.

대부분의 미량원심분리용 튜브는 polypropylene으로 만들어지며 연구에 따르면 DNA가 polypropylene 에 매우 잘 달라붙는 것으로 나타납니다.
Standards는 희석한 후 동결하지 않아야 합니다. detergent가 있는 경우에도 동결로 인해 DNA가 polypropylene에 영구적으로 결합하는 것으로 보입니다.
그러므로 Standards를 4°C로 유지하고 몇 주마다 fresh batch를 준비하는 것이 좋습니다.

반응이 억제되는 경우 어떻게 해결해야 할까요?

반응이 잘 진행되지 않으면 억제가 관찰되면 템플릿의 양이 감소할 수 있습니다.
이 경우 Ct 값은 증가시키지만 Taq DNA polymerase 활성을 방해하는 inhibitors가 생길 가능성을 낮추게 됩니다.
이런 경우 0.4~4 mg/ml의 BSA를 추가해 보십시오.
그전에 먼저 제품 설명서의 cycling conditions을 잘 지키고 있는지 다시 한 번 확인해 보십시오.

qPCRBIO Probe Mixes 를 사용할 때 비특이적 반응이 발생하는 경우 어떻게 해야하나요?

반응을 최적화할 때 고려해야 할 다양한 옵션이 있습니다.

1. annealing/extension 시간을 5초로 줄여봅니다.
2. annealing/extension 온도를60도에서 65°C 로 조정해 봅니다.
3. 5ng의 DNA로 시작하여 DNA 템플릿을 연속적으로 희석합니다.

비특이적 반응이 계속되는지 확인하기 위해 gel running 외에도 qPCR 기기의 소프트웨어를 사용하여 반응 효율을 계산할 수 있습니다.
효율이 90~110%이면 amplicon은 주기마다 두 배가 됩니다.

Ct 값이 평소보다 높을 때 권장되는 문제 해결 방법은 무엇입니까?

높은 Ct 값은 일반적으로 증폭이 지연되고 있다는 뜻입니다.
이는 반응에서 과량의 템플릿으로 인해 프라이머와 프로브가 서로 다른 DNA 분자에 결합되기 때문일 수 있습니다.
샘플에는 일반적으로 대상 유전자 이외의 많은 DNA가 있으며 이는 올리고의 결합을 혼란스럽게 할 수 있습니다.

이 문제를 해결하려면 샘플을 희석(10x~1000x)하는 것이 좋습니다.
또한, 올리고의 결합을 표적 서열에 보다 특이적으로 만들고 background signal을 감소시키기 위해 annealing/extension 온도를 증가시킬 수도 있습니다.

Multiplex assay를 수행할 때 각 primer의 권장 농도는 얼마입니까?

각 프라이머마다 0.4µM을 사용하는 것이 좋습니다.
이 권장 농도는 유연하게 조정 가능하지만, 프라이머 농도는 효소의 활성에 상당한 영향을 미칠 수 있으므로 증가해서는 안 됩니다.

다른 브랜드 제품과 동일한 프라이머와 PCR 조건을 사용할 때 비특이적 생성물이 생기는 이유는 무엇입니까?

아마도 1단계((hot start) 반응 시간이 너무 짧아서 그럴 것으로 생각됩니다.
효소를 완전히 활성화하려면 95°C에서 2분간 고온의 시작 단계가 완료되어야 합니다.

권장하는 thermal profile 은 다음과 같습니다.

1. 95°C (120 seconds)
2. 40 cycles: 95°C (5-15 seconds) - 60°C (20-30 seconds)
3. Melt

비특이적 결과물이 계속 생길 경우 사용된 프라이머 세트에 따라 annealing/extension를 60°C에서 65°C로 높이는 것이 좋습니다.

qPCRBIO Probe Mixes로 생성된 결과물은 digesting, cloning, and sequencing이 가능한가요?

예, qPCRBIO Probe Mixes로 생성된 PCR 산물은 wild-type Taq polymerase로 생성된 PCR 산물과 동일한 특성을 가지고 있습니다.
최상의 결과를 얻으려면 표준 PCR clean-up kit를 사용하여 PCR 산물을 정제하는 것이 좋습니다.

ROX dye 가 반응에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니까?

ROX(6-carboxy-X-rhodamine)는 real-time PCR 기기에서 passive reference dye로 사용되어 주로 well 간의 광학 경로 변화로 인해 발생할 수 있는 형광 수준의 변화를 균등하게 합니다.
ROX는 PCR 반응에 참여하지 않으며 형광 수준은 각 well의 DNA 양에 비례하지 않으므로 혼합물에 이 fluorophore를 추가하면 증폭 중에 일정한 형광 신호를 내게 됩니다.

passive reference standard 가 필요한 다양한 유형의 Real-Time PCR 기기는 주로 각 시스템의 다양한 광학 구성으로 인해 최적의 ROX 농도가 다릅니다.
너무 적거나 너무 많은 ROX를 추가하면 반응 결과에 영향을 미치는 매우 노이즈가 많은 신호가 발생합니다.
Real-Time PCR 결과를 최적화하기 위해 정확한 ROX 농도를 결정하고, 반응을 설정하는 데 사용된 소프트웨어에서 ROX 설정을 확인합니다.

qPCRBIO Probe Mixes에 들어있는 ROX의 농도는 아래와 같습니다.

qPCRBIO Probe Mix Lo-ROX (PB20.21) contains 112 nM ROX.
qPCRBIO Probe Mix Hi-ROX (PB20.22) contains 1.12 µM ROX.
qPCRBIO Probe Mix No-ROX (PB20.23) does not contain ROX.
qPCRBIO Probe Mix Separate-ROX (PB20.24) 2x mix contains no ROX + 50 µM ROX additive.

ROX를 사용한 signal normalization이 다른 브랜드의 mix에 비해 낮은 것으로 나타나면 무엇을 고려해야 합니까?

기기마다 다른 ROX 농도가 필요하기 때문에 올바른 농도의 ROX를 사용하고 있는지 확인하십시오.
예를 들어, qPCRBIO Probe Mixes Hi-ROX가 Lo-ROX mix가 필요한 기기와 함께 사용되는 경우 소프트웨어는 qPCRBIO 신호를 Hi-ROX 레벨에 대해 normalization합니다.
다른 브랜드의 제품에 대해 Lo-ROX mix가 선택된 경우 qPCRBIO mix의 형광 수준이 크게 감소하게 됩니다.

다른 제조업체의 mix를 비교할 때 데이터를 분석하기 전에 별도로 실험을 수행하거나 passive reference를 끄는 것이 좋습니다.

qPCRBIO Probe Mixes 에 FAM dye가 들어있나요?

아니요. ROX 외에 다른 염료는 없습니다. 따라서 반응에 fluorophore-conjugated probe를 사용할 수 있습니다.
qPCRBIO Probe Blue Mixes를 사용하는 경우 파란색 염료가 형광단의 형광을 방해하지 않도록 각 제품 설명서를 참조하십시오.

qPCRBIO Probe Mixes 에 들어있는 dNTPs의 양은 얼마나 되나요?

2mM(각각 0.5mM) 농도의 dNTP가 포함되어 있습니다.
이것은 반응의 최종 농도가 1mM(각각 0.25mM)임을 의미합니다.

qPCRBIO Probe Mixes 에 들어있는 MgCl2양은 얼마나 되나요?
12mM 농도의 MgCl2가 포함되어 있습니다. 이것은 반응의 최종 농도가 6mM임을 의미합니다.

Equipments

Eco 48 Real-Time PCR < 제품 상세보기 링크



• 384 well-base로 제작하여well간 온도 편차를 최소화
• 금으로 코팅된 Silver 재질로Block을 제작하여 ramping rate를 높이고 부식을 방지
• 각well에1대1로 대응하는 48개의 LED 사용하여 별도의 Calibration이 필요 없음
• 다른 장비 도움없이 자체적으로HRM analysis 가능

qPCRBIO Probe mix < 제품 상세 보기 링크



•multiplex reaction 에서 고효율
•초기 Ct 값에 대한 빠른 확장
•마켓을 선도하는 sensitivity
•GC 및 AT가 풍부한 시퀀스에서도 효율적인 증폭
•Antibody-mediated hot start technology
•대부분의 real-time PCR platforms과 호환

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