Application
열에 민감한 샘플에서 핵산을 안전하게 추출하는 법with SS lysing tube
샘플 준비
작성일
2021-10-29 18:23
Nucleic Acid Extraction from Mus musculus Tissues Using the Bead Ruptor Elite and Stainless Steel Lysing/Grinding Tubes
Background
동물 모델의 사용하는 생물학/의학 분야 연구에서 qPCR, RT-PCR 및 Next Gen Sequencing과 같은 downstream molecular applications을 위해 추출된 핵산은 질병 병리, 제약 및 게놈 변형 분석과 관련된 관심 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 이유로 실험 및 결과의 효율성과 정확성을 보장하기 위해 추출 과정에서 고품질의 DNA와 RNA를 얻는 것이 매우 중요합니다.
신선한 조직 샘플에서 핵산을 제대로 추출하려면 mechanical homogenization과 같은 과정을 통해 샘플을 파쇄해야 합니다.
기계적 균질화를 통해 샘플 조직이 파괴되고 많은 세포가 용해되어 세포 내에 포함된 대사 산물과 핵산이 노출됩니다.
이 용해 단계는 사용된 조직의 상태나 방법에 따라 어려울 수 있습니다.
예를들면, enzymatic digestion or manual homogenization 같은 용해 방법은 시간이 많이 걸리고 부적절한 프로세스 일 수 있습니다.
조직의 균질화 및 용해 단계를 위해 Omni Bead Ruptor Elite를 사용하면 총 처리 시간을 줄이면서 효과적인 샘플 파쇄가 가능합니다.
또한, Omni Stainless Steel Lysing/Grinding Tube 및 Grinding Cylinder 는 극저온 샘플 준비와 tough sample 균질화를 견딜 수 있는 내구성을 제공합니다.
Materials and Methods
Materials
• Bead Ruptor Elite (PN 19-042E)
• 2 mL Tube Carriage Kit (PN 19-010-310)
• Stainless Steel Lysing/Grinding Tube with Cylinder (PN 19-6001)
• Omni Tissue DNA Kit (PN 26-007)
• Omni Tissue RNA Kit (PN 26-010)
Methods
Tissue DNA Extraction
Grinding Cylinder(19-6001)가 있는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube에 간 조직 30mg을 첨가했습니다.
그 후 조직 검체가 들어있는 튜브를 닫은 후 전체 튜브를 LN2에 15초간 담갔습니다.
튜브는 즉시 Bead ruptor elite (19-042E)를 사용하여 3.9m/s에서 20초 동안 처리되었습니다.
분말화된 균질액을 200μl의 DNA 용해 완충액(DLB, 26-007)이 들어 있는 1.5mL microcentrifuge tube로 옮겼습니다.
키트 지침(26-007)에 따라 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 농도 및 무결성은 A260/A280 분광광도법에 의해 결정했습니다.
분광광도계 분석 후, 약 100ng의 용리된 DNA를 Tris-Borate-EDTA(TBE)를 넣은 2.0% 아가로스 겔에서 전기영동 했습니다.
염색 후, 표준 절차에 따라 gel documentation system에서 DNA 밴드를 시각화 했습니다.
Tissue RNA Extraction
Grinding Cylinder(19-6001)가 있는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube에 간 조직 30mg을 첨가했습니다.
조직 검체가 들어있는 튜브를 닫은 후 전체 튜브를 LN2에 15초간 담갔습니다.
튜브는 Bead ruptor elite (19-042E)를 사용하여 3.9m/s에서 20초 동안 즉시 처리되었습니다. (표 1).
분말화된 균질액을 700μl의 pre-chilled RNA Lysis Buffer (RLB, 26-010)와 β-mercaptoethanol (βME)이 들어 있는 1.5mL microcentrifuge tube로 옮겼습니다.
그런 다음 키트 지침(26-010)에 따라 RNA를 추출하고 추출된 RNA의 농도 및 무결성은 A260/A280 분광광도법에 의해 결정하였습니다.
분광광도계 분석 후, A사의 Bioanalyzer를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 RNA를 추가로 분석하여 RNA Integrity Number (RIN) 및 gel electropherogram을 얻었습니다.
Results
Stainless Steel Lysing/Grinding tube를 사용하여 Bead Ruptor Elite에서 30mg의 간 조직을 균질화하여 평균 농도 156ng/μl인 DNA 및 423ng/μl인 RNA를 산출했습니다(표 2, 표 3).
DNA의 평균 A260/A280 비율은 1.9인 반면, RNA의 평균 A260/A280 비율은 2.07이고 평균 RIN 값은 8.4입니다 (표 2, 표 3).
2.0의 A260/A280 비율은 pure한 핵산으로 간주되는 반면 >8의 RIN 값은 대부분의 온전한 RNA 샘플에 해당하며 전사체 분석에 대한 적합성을 나타냅니다.
또한, RIN 값은 18S~28S ribosomal subunit의 비율을 측정하고 그에 따라 RNA의 상태를 예측하는 알고리즘을 기반으로 할당됩니다.
마지막으로, 겔 전기영동으로 분리한 후, 용출된 핵산은 고분자량으로 나타났으며 최소한의 분해 징후를 보였습니다(그림 1, 그림 2).
Conclusions
제시된 데이터는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube가 downstream analysis에 적합한 완전한 homogenate 를 성공적으로 만들어준다는 것을 보여줍니다.
핵산 정제 후, A 260 /A 280 분광 광도 분석 및 시각화된 젤은 순수한 핵산이 고농도로 추출되었음을 보여줍니다.
이 유용한 tube는 사용자에게 단단한 섬유 조직 샘플의 처리를 균질화 전에 LN 2를 사용하여 샘플을 극저온 처리할 때에도 견딜 수 있는 충분한 내구성을 가지고 있습니다.
Background
동물 모델의 사용하는 생물학/의학 분야 연구에서 qPCR, RT-PCR 및 Next Gen Sequencing과 같은 downstream molecular applications을 위해 추출된 핵산은 질병 병리, 제약 및 게놈 변형 분석과 관련된 관심 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
이러한 이유로 실험 및 결과의 효율성과 정확성을 보장하기 위해 추출 과정에서 고품질의 DNA와 RNA를 얻는 것이 매우 중요합니다.
신선한 조직 샘플에서 핵산을 제대로 추출하려면 mechanical homogenization과 같은 과정을 통해 샘플을 파쇄해야 합니다.
기계적 균질화를 통해 샘플 조직이 파괴되고 많은 세포가 용해되어 세포 내에 포함된 대사 산물과 핵산이 노출됩니다.
이 용해 단계는 사용된 조직의 상태나 방법에 따라 어려울 수 있습니다.
예를들면, enzymatic digestion or manual homogenization 같은 용해 방법은 시간이 많이 걸리고 부적절한 프로세스 일 수 있습니다.
조직의 균질화 및 용해 단계를 위해 Omni Bead Ruptor Elite를 사용하면 총 처리 시간을 줄이면서 효과적인 샘플 파쇄가 가능합니다.
또한, Omni Stainless Steel Lysing/Grinding Tube 및 Grinding Cylinder 는 극저온 샘플 준비와 tough sample 균질화를 견딜 수 있는 내구성을 제공합니다.
Materials and Methods
Materials
• Bead Ruptor Elite (PN 19-042E)
• 2 mL Tube Carriage Kit (PN 19-010-310)
• Stainless Steel Lysing/Grinding Tube with Cylinder (PN 19-6001)
• Omni Tissue DNA Kit (PN 26-007)
• Omni Tissue RNA Kit (PN 26-010)
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Tissue DNA Extraction
Grinding Cylinder(19-6001)가 있는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube에 간 조직 30mg을 첨가했습니다.
그 후 조직 검체가 들어있는 튜브를 닫은 후 전체 튜브를 LN2에 15초간 담갔습니다.
튜브는 즉시 Bead ruptor elite (19-042E)를 사용하여 3.9m/s에서 20초 동안 처리되었습니다.
분말화된 균질액을 200μl의 DNA 용해 완충액(DLB, 26-007)이 들어 있는 1.5mL microcentrifuge tube로 옮겼습니다.
키트 지침(26-007)에 따라 DNA를 추출하고, 추출된 DNA의 농도 및 무결성은 A260/A280 분광광도법에 의해 결정했습니다.
분광광도계 분석 후, 약 100ng의 용리된 DNA를 Tris-Borate-EDTA(TBE)를 넣은 2.0% 아가로스 겔에서 전기영동 했습니다.
염색 후, 표준 절차에 따라 gel documentation system에서 DNA 밴드를 시각화 했습니다.
Tissue RNA Extraction
Grinding Cylinder(19-6001)가 있는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube에 간 조직 30mg을 첨가했습니다.
조직 검체가 들어있는 튜브를 닫은 후 전체 튜브를 LN2에 15초간 담갔습니다.
튜브는 Bead ruptor elite (19-042E)를 사용하여 3.9m/s에서 20초 동안 즉시 처리되었습니다. (표 1).
분말화된 균질액을 700μl의 pre-chilled RNA Lysis Buffer (RLB, 26-010)와 β-mercaptoethanol (βME)이 들어 있는 1.5mL microcentrifuge tube로 옮겼습니다.
그런 다음 키트 지침(26-010)에 따라 RNA를 추출하고 추출된 RNA의 농도 및 무결성은 A260/A280 분광광도법에 의해 결정하였습니다.
분광광도계 분석 후, A사의 Bioanalyzer를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 RNA를 추가로 분석하여 RNA Integrity Number (RIN) 및 gel electropherogram을 얻었습니다.
Results
Stainless Steel Lysing/Grinding tube를 사용하여 Bead Ruptor Elite에서 30mg의 간 조직을 균질화하여 평균 농도 156ng/μl인 DNA 및 423ng/μl인 RNA를 산출했습니다(표 2, 표 3).
DNA의 평균 A260/A280 비율은 1.9인 반면, RNA의 평균 A260/A280 비율은 2.07이고 평균 RIN 값은 8.4입니다 (표 2, 표 3).
2.0의 A260/A280 비율은 pure한 핵산으로 간주되는 반면 >8의 RIN 값은 대부분의 온전한 RNA 샘플에 해당하며 전사체 분석에 대한 적합성을 나타냅니다.
또한, RIN 값은 18S~28S ribosomal subunit의 비율을 측정하고 그에 따라 RNA의 상태를 예측하는 알고리즘을 기반으로 할당됩니다.
마지막으로, 겔 전기영동으로 분리한 후, 용출된 핵산은 고분자량으로 나타났으며 최소한의 분해 징후를 보였습니다(그림 1, 그림 2).
| Sample Type | Sample Weight(mg) | Speed (m/s) | Time (sec) | Cycles | Dwell Time (sec) |
| Tissue | 30 | 3.9 | 20 | 1 | N/A |
| Table 1: Bead Ruptor Elite Sample Homogenization Summary | |||||
| Sample | DNA Concentration (ng/μl) | A260/A280 |
| Liver 1 | 128.7 | 1.9 |
| Liver 2 | 188.2 | 1.9 |
| Liver 3 | 162.0 | 1.08 |
| Table 2: Spectrophotometric data obtained from Tissue DNA eluate | ||
| Sample | DNA Concentration (ng/μl) | A260/A280 | RIN Value |
| Liver 1 | 429.3 | 2.06 | 8.2 |
| Liver 2 | 429.7 | 2.07 | 8.6 |
| Liver 3 | 410.8 | 2.09 | 8.5 |
| Table 3. Spectrophotometric data obtained from Tissue RNA eluate | |||
 |
 |
| Gel Electrophoresis data obtained from Tissue DNA eluate | Gel Electrophoresis data obtained from Tissue RNA eluate |
Conclusions
제시된 데이터는 Stainless Steel Lysing/Grinding Tube가 downstream analysis에 적합한 완전한 homogenate 를 성공적으로 만들어준다는 것을 보여줍니다.
핵산 정제 후, A 260 /A 280 분광 광도 분석 및 시각화된 젤은 순수한 핵산이 고농도로 추출되었음을 보여줍니다.
이 유용한 tube는 사용자에게 단단한 섬유 조직 샘플의 처리를 균질화 전에 LN 2를 사용하여 샘플을 극저온 처리할 때에도 견딜 수 있는 충분한 내구성을 가지고 있습니다.
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