Introduction

Passive reference dyes는 qPCR reactions에서 non-PCR-related fluorescence signal 의 편차를 줄이기 위해 일반적으로 사용됩니다.

1. 피펫팅 에러.
2. 장비의 well간 편차
3. qPCR 실행 중 반응 혼합물의 농도 또는 부피 변화

여기서는 위의 3가지 상황에서 qPCR에서 passive reference dyes을 사용할 때의 장단점을 알아보고자 합니다.

Passive Reference in Practice

도입된 첫 번째 passive reference는 qPCR master mix에 ROX (6-Carboxyl-X-Rhodamine, lmax – 610nm)를 추가하는 것이었습니다.
흔히 "ROX normalization" 이라고 합니다. 다만 ROX는 농도가 너무 높으면 PCR을 억제할 수 있습니다.

ROX and Pipetting Errors

ROX normalization은 피펫팅 에러로 인한 변화를 계산하는 데 도움이 될 수 있다고 믿어집니다.
그러나 passive reference dye가 master mix에 있기 때문에 신호는 사용된 master mix의 양과 상관 관계가 있으며 타겟의 양과는 관련이 없습니다.
Master mix가 아닌 template mix에 passive reference dye를 추가하면 normalization에 약간의 이점이 있을 수 있습니다.
그러나 ROX는 DNA와 상호 작용하기 때문에 주의가 필요합니다.

ROX and Bubbles

ROX normalization의 가장 중요한 장점은 거품으로 인한 PCR 중 샘플의 변화를 수정할 수 있다는 것입니다.
대부분의 detector는 well 바닥의 예상 위치에 있을 때 샘플에서 형광 신호를 수집하도록 최적화되어 있으므로,
샘플을 well 바닥에서 들어올리는 expanding bubble과 같은 샘플의 모든 움직임은 신호 다운이나 PCR 반응 자체에는 크게 영향을 받지 않습니다.

샘플이 기포에 의해 검출기내에서 단순히 이동되기만해도 보정 작업이 진행됩니다.
passive reference dye 와 sample probe dye가 모두 균일하게 분포되기 때문에 형광 신호는 서로 비례하여 변경됩니다.
즉, passive reference를 통한 bubble compensation은 passive reference와 probe 모두의 광학 경로가 동일하고 이상적으로는 두 신호가 동시에 수집되는 경우에만 작동합니다.

ROX, Condensation, and Evaporation

때로는 응축 및 증발 손실 모두 passive reference normalization으로 보상할 수 있다고 생각 되기도 합니다.
그러나 응축 및 증발 손실 모두 반응 혼합물에서 물을 제거하여 반응을 어렵게 합니다.
단 하나의 차이점은 응축의 경우 물은 튜브 벽과 뚜껑에 그대로 남아 있는 반면 증발 손실의 경우 튜브 밖으로 완전히 빠져나간다는 것입니다.
두 경우 모두 반응으로 인한 수분 손실은 반응 혼합물의 농도를 변화시키고 성장 곡선에 영향을 미치도록 PCR 반응에 직접적인 영향을 미칩니다.
Passive reference로는 이 효과를 보정할 수 없습니다.

ROX and System Variation over Time

할로겐 램프 및 레이저와 같은 일부 excitation source는 기기 수명에 따라 정기적으로 교체하거나 출력 강도를 변경해야 합니다.
예를 들어 할로겐 램프 출력은 일반적으로 1000시간 정도이며 교체 시 기존 램프와 다른 광 에너지가 발생할 수 있습니다.
이러한 요인 때문에 시간이 지남에 따라 시스템 성능을 유지하기 위해서는 에너지 강도 변화에 대한 적정 수준의 보정이 필요합니다.

일부 제조사에서는 passive reference normalization으로 이 문제를 해결합니다.
그러나 Eco 48은 이 문제를 해결하기 위해 수명이 긴 LED 조명을 두 뱅크에 사용하므로 보정을 위해 ROX 또는 다른 reference 를 추가할 필요가 없습니다.

Passive Reference normalization in Eco 48

Eco 48은 두 개의 광학 파장(파란색과 녹색)에서 반응합니다. 반면 데이터는 네 개의 방출 파장에서 수집됩니다.
두 파장은 파란색으로 측정되고 다른 두 파장은 녹색으로 측정됩니다.
CY5와 같은 스펙트럼의 끝에 있는 빨간색 염료로 성능을 향상시킴으로써 파란색 들뜸만 있는 시스템에 비해 검출 민감도를 개선합니다.

Eco 48은 주어진 emission channel의 모든 well에 대한 데이터를 동시에 수집합니다.
Eco 48은 이를 four point spectrum으로 처리하고, 수학적으로 복잡함을 제거하는 과정을 거쳐 광학 범위에서 최대 4개 염료의 혼합을 읽을 수 있습니다.

Eco 48은 매우 긴 수명의 LED를 excitation source로 사용합니다.
LED는 기기의 수명 동안 변경, 고장 또는 소멸되지 않아 에너지 감소에 대한 보정이 필요하지 않으며, 램프 교체 및 성능 저하로 인한 excitation variability를 수정할 필요도 없습니다.

Eco 48은 excitation과 emission이 다른 광학 경로를 사용하는 off-axis excitation optics을 사용합니다.
이로 인해 사용자 설치 시 움직이는 부품을 최소화하고 광학 에너지 손실을 방지하게 됩니다.
그러나 이 설계는 ROX normalization이 Eco 48 시스템에서 다른 방식으로 구현되어야 함을 의미합니다.
blue LED에 대한 excitation path는 튜브의 한쪽으로 연결되고 green excitation은 다른 쪽으로 연결되기 때문에 한 채널에서 다른 채널보다 훨씬 더 강하게 보이는 샘플에 거품이 형성될 수 있습니다.
예를 들어 reporter가 FAM(파란색)이고 passive reference가 ROX(녹색) 이라고 가정하면,
거품이 주로 파란색 excitation path에서 형성될 경우 파란색 신호의 하락은 ROX의 하락보다 초기 신호에서 더 클 것이므로 ratio도 떨어지고 보정도 부적절할 것입니다.

Conclusion
passive reference의 사용은 사용 중인 기기 시스템과 무관하게 qPCR 데이터에 소소한 문제점을 일으킵니다.
그러나 많은 실험실에서 이 방법이 PCR과 관련되지 않은 변동성을 식별하고 부분적으로 보정하는 향상된 기능이 그만한 가치가 있다고 판단하고 있습니다.

Diagnostic Power of a Passive Reference Channel

A passive reference signal 은 다음을 교정할 수 있습니다.
Bubbles forming in the well during PCR (광학 시스템에 따라 다름)

진단에 사용할 수 있지만 다음에 대해서는 정확하지 않습니다.

• Bubbles forming in the well during PCR (광학 시스템에 따라 다름)
• Some pipetting errors
• Poor mixing
• Evaporative loss

다음은 할 수 없는 작업입니다.

• Normalize for pipetting errors
• Normalize for changes in concentration during PCR due to evaporative loss
• Normalize for well-to-well optical variations of the instrument

Does Eco 48 Need Passive Reference Normalization? 

Eco 48은 실행 중에 광학 변화를 일으키지 않으므로 passive reference normalization 이 필요하지 않습니다.
Well에서 형성되는 기포에 대한 보정 또는 normalization은 일부 시스템에서 잘 작동할 수 있지만 기포가 샘플의 thermal profile에 실질적인 영향을 미치고,
결과적으로 PCR에 영향을 줄 수 있기 때문에 이것이 마이크로플레이트 기반 시스템에서 좋은 아이디어인지는 의문입니다.
데이터의 변화는 광학 및 실제 PCR 효율성 변화로 인해 발생할 수 있습니다.

결론적으로 Eco 48은 다음과 같은 이유로 passive reference normalization 이 필요하지 않습니다.

• Eco 48 optical detection은 시간이 지나도 변하지 않습니다.
• Eco 48 광학 장치는 처음 만들어질 때 특정 염료 농도로 보정 됩니다.

Equipment

Eco 48 Real-Time PCR  제품 상세정보 보러가기




• Real-time PCR은 정량을 목적으로 하는 만큼 증폭조건의 정확성과 균일성, 그리고 형광측정의 민감성과 정확성 등이 중요합니다.
Eco48은 Block간 온도편차를 최소화하고 정확성을 높이기 위해서 384-well 포맷의 48 well block으로 제작하여 온도 조절능력을 높였습니다.
• Silver 재질로 제작한 block은 gold로 coating하여 ramping 속도를 높이고 부식을 방지 하였습니다.
• 또한 48 well 각각에 대응하는 48개의 LED (Blue, Green 각각)를 이용하므로 추가적인 calibration이 필요 없는 장점을 가지고 있습니다.

 

 

 

 

Applications 

Absolute & Relative Quantitation

• Absolute quantification standard curves with efficiency calculation.
• Relative quantification for multiple reference gene normalization.
• Relative gene expression with efficiency control.
• Next-Generation Sequencing (NGS) library quantification.
• Copy Number Variation: insertions, deletions, inversions.
• RNA Characterization: siRNA and miRNA.
• Viral load.

Genotyping and High-resolution melting

• Allelic Discrimination.
• DNA Methylation.
• SNP Verification • Microbiology: pathogen detection and identification.

High resolution melting (HRM)

• Genotyping, methylation studies, and mutation screening.