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형질주입 된 세포의 카운팅 및 효율 분석 by cytoSMART cell counter

세포배양
작성일
2021-08-10 10:40
Fluorescence imaging and counting of transfected cells (형질주입 된 세포의 카운팅 및 효율 분석)

Introduction to transfection

형질주입 혹은 형질감염(Transfection)은 외래 핵산을 진핵세포에 도입하여 숙주 세포 게놈을 변형시키는 과정입니다.
변형은 외인성 유전 물질의 발현을 통하거나 내인성 gene silencing을 통해 일어날 수 있습니다.

형질주입은 유전자 조절 및 단백질 기능에 대해 더 많은 정보를 제공할 수 있으므로 세포 생리학 및 질병의 복잡한 분자 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 도구입니다.
플라스미드 DNA(pDNA) 및 small interfering RNA(siRNA), microRNA(miRNA) 그리고 short hairpin RNA(shRNA)2와 같은 작은 비암호화 RNA를 비롯한 다양한 유형의 핵산이 포유동물 세포에 형질주입될 수 있습니다.
온전한 기능 단백질(예: Cas9, 재조합 단백질, 항체) 및 펩티드도 세포에 직접 전달할 수 있어 임상 적용에 상당한 잠재력을 제공합니다.

이는 생물학적(transduction), 물리적(electroporation, microinjection), 화학적(lipofection, calcium phosphate transfection) 방법으로 세분화될 수 있습니다.

바이러스 매개 전이 (virus-mediated transfection)라고도 알려진 형질주입은 핵산의 전달을 위해 lentiviruses 나 retroviruses 같은 바이러스 벡터를 사용합니다.
이러한 방법은 바이러스가 숙주 세포에 접근할 수 있는 고유 기능으로 인해 충분히 높은 주입 효과를 얻을 수 있습니다.
그러나 바이러스를 보유한 호스트의 면역성, 세포독성, 종양 유발 잠재력을 고려해야 하는 등, 몇 가지 문제가 있어 주의가 필요합니다.

물리적/기계적 접근법은 어떤 운반체도 없이 핵산을 숙주 세포의 cytosol 이나 핵에 강제로 주입하는 것을 말합니다.
예를 들어, electroporation은 핵산을 전달하기 위해 일상적으로 사용되며 세포막의 일시적인 불안정성을 유발하는 고강도 전기 펄스를 주어 진행됩니다.

마지막으로, 화학적인 방법은 양전하를 띤 벡터와 음전하를 띤 핵산의 능력을 활용하여 핵산-벡터 복합체를 형성합니다.
이러한 복합체들의 결과적인 전하가 양성으로 남아있기 때문에, 세포의 음전하를 띤 막에 끌어당기게 됩니다.

적절한 프로토콜을 선택하기 전에 실험 목표, 세포 유형, 그리고 주입된 분자의 성질을 포함한 여러 요인을 고려해야 합니다.
어떤 방법이든 간에 세포의 생존에 미치는 영향을 최소화 하면서 형질주입 효율을 최대로 끌어 올릴 수 있어야 이상적인 방법이라고 할 수 있습니다.



Evaluation of transfection efficiency

Transfection의 효율은 외부 요소를 가지게 된 세포의 비율로 판단할 수 있으며 다양한 접근 방식을 사용하여 확인할 수 있습니다.

첫째, 형질주입 후 표적 유전자 또는 단백질 발현의 분석을 통해 형질주입 효율을 확인하고 정량화할 수 있습니다.
이 방법은 형질주입 된 세포 집단에서 총 유전자/단백질 발현 비율을 평가하며, western blotting, real-time qPCR, reporter system, or molecular imaging 등을 통해 확인 가능합니다.

두번째로 전체 세포 집단 내에서 형질주입 된 세포의 비율을 결정하여 효율을 평가할 수도 있습니다.
이것은 형질주입 된 유전자를 fluorescent reporter와 결합시켜 별도의 delivery vector에 삽입하거나 transcriptional/translational reporter gene fusion을 통해 확인할 수 있습니다.

마지막으로 유세포 분석법 (flow cytometry)이나 형광 현미경을 사용하여 형광 세포의 수를 추정하여 효율을 평가할 수도 있습니다.

Exact FL: endpoint analysis of transfection efficiency

CytoSMART Exact FL은 확장된 시야와 향상된 광학 분해능을 갖춘 자동화된 듀얼 형광세포계수기로써 정확하고 신뢰할 수 있는 형질주입 효율 분석을 가능하게 합니다.
다른 현미경 기반 접근 방식과 유사하게 Exact FL은 샘플에서 형질주입 된 형광표지세포를 직접 시각화 합니다.

형질주입 효율을 측정하기 위해, GFP와 같은 리포터 유전자를 함유하는 구조물로 형질주입 된 세포를 counting chamber에 로딩한 다음, 샘플을 count stage에 놓아 고해상도 이미지를 캡처합니다.
이미지는 AI 기반 이미지 분석 소프트웨어가 자동으로 처리하여 주입된 세포의 비율을 싑게 정량화 해 줍니다.

이렇듯 사용성 과 정확성을 갖춘 CytoSMART Exact FL 이야말로 형질주입 효율성 분석에 매우 이상적인 도구라고 할 수 있습니다.

Equipment

CytoSmart EXACT FL Fluorescence Cell Counter -> 상세정보 보러가기
The CytoSMART Exact FL 은 자동화된 dual fluorescence cell counter입니다.



• 멀티카운트 – 한 샘플의 여러 이미지를 촬영하여 계수 정확도를 높임
• 강력한 cell 식별 알고리즘 – cell clusters 내 개별 cell 식별
• 혁신적인 organoid 계수 – 다양한 모양과 크기의 오르가노이드 카운팅 (옵션)
• 안전한 데이터 저장 – 실험 데이터를 클라우드에 안전하게 저장하고 액세스
• 소프트웨어 업데이트 자동화 – 최신 소프트웨어 업데이트 지원
• 다양한 슬라이드와 호환 가능 – 보유중인 cell counting slides 사용

Applications Field

+ Fluorescence-based cell viability analysis
+ Cell viability
+ Small and hard-to-detect cells
+ Primary cell samples
+ Heterogeneous cell populations
+ Transfection efficiency
+ Distinguishing whole cells from debris

References
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Tags
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